同一基因区域，同时出现“激活”与“抑制”标记，意味着什么？

在组蛋白修饰研究中，我们常用H3K4me3观察启动子相关状态，用H3K27me3追踪Polycomb相关抑制。但当两个标记出现在同一基因区域时，问题往往才刚刚开始：

• 两种修饰是否真正共存于同一染色质片段？
  
• 这种组合在分化、疾病或药物处理后如何变化？
  
• 为什么相似的修饰组合，有时对应不同的基因表达结果？
  

这些问题是研究组蛋白修饰串扰与二价染色质的重要切入点。本期，我们结合Hi-Plex CUT&Tag（简称HCT）技术原文与景杰生物分析实例，看看HCT如何帮助研究者获取共定位证据，并进一步追踪染色质状态与转录变化的联系。

“组蛋白密码”模型认为，单个修饰并不是孤立信号。不同修饰可按序出现或形成组合，并被相应效应蛋白识别。所谓组蛋白修饰交叉会话（crosstalk），就是一种修饰影响另一种修饰的建立、去除、识别或功能发挥【1】。研究修饰交叉会话，既需要知道修饰发生在哪里，也需要关注它与哪些标记共同出现，以及这种组合与基因转录调控之间的关系。

经典的二价染色质通常指H3K4me3与H3K27me3共同标记的染色质区域。早期研究在胚胎干细胞中发现，这类区域常与低表达的发育调控基因相关，并提出其可能使基因在保持沉默的同时保留激活潜能；随后开展的全基因组研究进一步描绘了二价结构在多能状态与谱系分化过程中的动态变化【2,3】。

因此，H3K4me3的出现不能单独等同于基因已经活跃表达；二价标记的存在，也不能保证基因随后一定被激活。它们的意义需要结合细胞类型、其他染色质标记和转录结果判断。

二价共定位为研究修饰组合提供了切入点；若要进一步证明其交叉会话的功能，还需要后续扰动和验证实验。

在过去的研究中，分别开展激活性修饰如H3K4me3和抑制性修饰如H3K27me3的ChIP-seq或CUT&Tag，再取两组peak的交集，可以筛选候选二价区域。但在群体样本中，相同基因组坐标上的信号，可能来自不同细胞或不同染色质分子。仅凭位置重叠，难以确认两种标记是否共存。

HCT通过带有不同条形码的抗体与Tn5体系，在同一次实验中检测多个靶标。当一个片段的两端分别携带不同靶标的条形码时，即形成Heterotone信号，提示两个靶标在同一细胞、同一染色质片段上邻近共存，为共定位判断提供更直接的片段级证据【8】。

在二价染色质研究中，H3K4me3–H3K27me3的Heterotone可帮助定位具有片段级共存证据的区域，并结合各靶标的分布信息进行解释。

读懂HCT结果，可以关注两类互补信息：

• Singletone-SE：整合可归属于某一靶标的Homotone与Heterotone单端信号，用于观察该靶标的整体分布与富集表现。
  
• Heterotone：关注特定靶标对的共定位片段及其基因组位置，为修饰组合研究提供直接读出。
  

例如，景杰生物分析报告以H3K27me3–H3K4me3共定位peak为锚点，展示两种修饰各自的Homotone信号，帮助检查共定位区域与相应单靶标信号的位置一致性。

图1 以H3K27me3–H3K4me3共定位peak为中心的信号分布

（数据来源：景杰生物内测数据报告；两幅图纵轴刻度不同，不宜直接比较不同靶标的信号高低）

在景杰生物内测数据中，EZH抑制剂处理72 h后，共定位peak附近的H3K27me3 Homotone信号明显下降，而H3K4me3整体变化较小。该结果符合EZH抑制后H3K27me3降低的生物学预期，也说明HCT能够捕捉药物扰动引起的靶向修饰变化。

需要注意：HCT中的“同一片段”并不等于“同一条组蛋白尾部”，也不能直接推断两个靶标位于同一核小体或发生蛋白互作。HCT提供的是片段级共定位证据，仍需结合片段长度和实验设计进行解释。

HCT技术原文给出了一个有代表性的案例：研究者使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠处理K562细胞，并联合开展HCT与RNA-seq分析，以观察药物处理后的染色质与转录变化【8】。

处理后，四个基因启动子区域的H3K27me3–H3K4me3组合信号均增强，但转录变化方向并不相同：

研究者进一步观察到，SLCO3A1和SFXN3启动子的H3K4me3 Homotone信号增加，而KCTD9和KMT2E-AS1未出现相同变化；其他修饰组合也呈现不同的变化模式。

这提示我们：解释二价染色质，需要把它放回更完整的染色质背景中。

对具体课题而言，除H3K4me3与H3K27me3外，加入H3K27ac等标记，可以帮助判断候选区域是否伴随活性相关信号变化。再结合RNA-seq数据，可进一步识别哪些组合变化与基因表达响应相关。

上述结果来自HCT技术预印本中的研究案例，不是景杰生物项目的内测结果，也不代表每个模型都会出现相同规律。

以细胞分化前后，或对照与表观调控酶干预组为例，可以先从具有H3K4me3–H3K27me3共定位证据的候选启动子出发，观察处理后哪些区域保留、减弱或新增这一组合。

如果二价组合减弱，同时出现H3K27me3下降、H3K4me3保留，并伴随H3K27ac和RNA表达升高，提示该区域可能向活性状态转变。相反，若H3K4me3下降、抑制性信号保留且RNA表达降低，则可能向抑制状态转变【3,4】。

示意图｜二价染色质状态变化的两种可能方向。左：H3K27me3下降、H3K4me3保留并获得H3K27ac，伴随RNA升高；右：H3K4me3下降、H3K27me3保留，伴随RNA降低。该图为概念示意，不代表单一位点必然遵循此路径。

这些是用于分析的判断思路，不能仅凭某一个peak的出现或消失下结论。比较时还需考虑生物学重复、测序深度、归一化及细胞组成变化。

当多种修饰同时变化时，逐个查看peak很容易遗漏整体规律。HCT与RNA-seq联合分析可先将具有相似染色质状态的基因组区域归为row cluster，再将变化模式相近的修饰组合或调控因子组合归为CRF（Chromatin regulatory factors） pair cluster。

随后，按实验组展示HCT平均信号，并叠加关联基因的RNA表达量（TPM，Transcripts Per Million），即可快速锁定值得进一步验证的模块和基因。

 图2 景杰生物内测数据WT与EZHi组HCT双聚类热图及WT组RNA TPM分布

（双聚类热图按照相同的row cluster顺序，分别展示WT和EZHi组各CRF pair的平均归一化信号；箱线图展示WT组各row cluster关联基因的log₁₀(TPM)分布。二者并列可直观看出染色质组合模块与转录水平的对应关系，例如H3K27me3相关信号较高的cluster B–H所对应的染色质模块，整体基因表达水平较低；EZHi处理后，H3K27me3相关信号在多个模块中明显下降）

图3 景杰生物HCT与RNA-seq联合分析内测报告中的WT对照组及EZHi处理组双差异联合分析

（图中展示EZHi组相对WT组的CRF组合信号变化及对应基因的RNA表达方向。以H3K27me3为主的cluster 2和cluster 5整体信号下降，对应基因表达上升；H3K27ac相关的cluster 3和cluster 4则表现为CRF组合信号与基因表达同步上升。该结果提示两类修饰在本模型中呈现不同的变化方向，但其功能关系仍需进一步实验验证）

综合这些结果，我们可以回答，哪些修饰组合在处理后发生变化？它们关联的基因表达变化情况是什么？沿着候选区域进一步分析，可以回答：这些变化的修饰集中在启动子还是其他区域，并涉及哪些生物学过程？

通过这些结果，可以优先选择共定位证据清晰、组间变化稳定并与课题表型相关的区域及基因，进入后续验证。

若要进一步回答“A修饰是否影响B修饰”，仍需干预相关修饰酶或调控因子，检测B修饰在候选区域的变化，并结合回补、靶基因表达和表型实验进行验证。HCT负责发现线索、缩小范围；功能因果关系则需要后续实验建立。

针对二价染色质与修饰串扰研究，可从H3K4me3、H3K27me3和H3K27ac组成的三靶标方案起步。前两者用于关注经典二价组合，H3K27ac提供活性相关状态的补充信息。近年来研究还发现，激活性与抑制性标记也可在同一调控单元的不同区段形成非经典组合。例如，SVA（SINE-VNTR-Alu）复合转座子可在5′端富集H3K9me3、在3′端富集H3K27ac，共同参与其转录与增强子功能调控【5】。

如果课题需要更全面的染色质背景，可进一步加入H3K4me1和H3K9me3，分别补充增强子相关与异染色质相关信息。关注转录延伸时，也可评估加入RNAPII-S2P；研究新型修饰时，则可结合假设评估H3K18la、H3K9la或H3K27cr等靶标。组蛋白乳酰化与巴豆酰化的发现也拓展了代谢状态与染色质调控之间的研究维度【6,7】。具体组合需结合抗体验证情况、样本条件、前期课题研究结果来确定。

多个成对共定位信号可以帮助解析组合模式，但不能直接证明三个或更多靶标同时存在于同一分子上【8】。

以下课题尤其值得考虑：

• 干细胞与谱系分化：追踪发育相关基因的二价状态及其表达响应。
  
• 肿瘤与药物应答：比较敏感与耐药、处理前后样本，寻找与转录重编程相关的修饰组合。
  
• 组蛋白修饰串扰：已有候选修饰或调控酶，希望定位其与其他标记共同变化的染色质区域。
  
  
  

研究设计上，建议设置清晰的生物学对照，并尽量保证每组至少3个生物学重复。细胞或细胞核数量、保存方式及靶标适配性，可在项目启动前进行评估。

景杰生物HCT定制化研究方案

景杰生物Hi-Plex CUT&Tag提供从靶标Panel设计、样本方案评估、实验检测到生信解读的一站式定制服务，并可进一步开展HCT与RNA-seq联合分析，将组蛋白修饰组合变化与转录响应纳入同一分析框架，形成从多靶标共定位检测到转录关联解读的完整交付链路。

HCT中秋限时礼遇

活动截止至 2026年12月30日

如果您正在研究组蛋白修饰串扰、二价染色质或细胞状态转换，欢迎联系景杰生物，获取 HCT 技术资料、靶标组合建议及 1V1 课题方案咨询。

技术咨询：400-100-1145

参考文献

【1】Strahl BD, Allis CD. The language of covalent histone modifications. Nature. 2000;403(6765):41–45. DOI: 10.1038/47412.

【2】Bernstein BE, et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 2006;125(2):315–326. DOI: 10.1016/j.cell.2006.02.041.

【3】Mikkelsen TS, et al. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature. 2007;448(7153):553–560. DOI: 10.1038/nature06008.

【4】Creyghton MP, et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(50):21931–21936. DOI: 10.1073/pnas.1016071107.

【5】Zhou Z, Zhu S, Hong Y, et al. Composite transposons with bivalent histone marks function as RNA-dependent enhancers in cell fate regulation. Cell. 2025;188(21):5878–5894.e18. DOI: 10.1016/j.cell.2025.07.014.

【6】Zhang D, et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019;574(7779):575–580. DOI: 10.1038/s41586-019-1678-1.

【7】Tan M, et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 2011;146(6):1016–1028. DOI: 10.1016/j.cell.2011.08.008.

【8】Liao Y, et al. Global Mapping of Combinatorial Chromatin Regulatory Events Using Hi-Plex CUT&Tag. bioRxiv. 2025. DOI: 10.1101/2025.10.06.680180.