Western blot——就是让你完美

凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高。

可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

样品溶解不好。

样品中含有不溶性颗粒。

电极不平衡或者加样位置偏斜。

加样量过多。

一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度。

对比不同的封闭缓冲液。

1. 优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性；

2. 提高封闭液中蛋白的浓度；

3. 在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05%。

1. 换一种不同的封闭液；

2. 不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素。

1. 保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥；

2. 在孵育过程中始终进行震荡；

3. 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合。

配置新的缓冲液。

若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度。

1. 转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率；（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原）

2. 确保转膜过程中胶与膜完全接触；

3. 确保转印夹层排布正确；

4. 确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜；

5. 确保转印部件在电印迹过程中未过热；

6. 使用正对照和/或分子量Marker；

7. 优化转印时间和电流；

8. 确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。 （注意：许多蛋白不能在还原状态下进行）

在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。

增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小；

抗体可能失活，可用斑点印迹检测其活性。

使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。

1. 加入更多的蛋白进行跑胶；

2. 抗原被封闭液掩蔽；

3. 试用不同的封闭液；

4. 优化封闭液中蛋白浓度。

叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。

延长胶片的曝光时间（注意：超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时）。

在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。

1. 超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月；

2. 为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的HRP结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或HRP结合物均有可能失活；

3. 确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降。

封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶）。

准备一张新的印迹膜。