邹文安
质谱搜库的那些事（一）
2015年Nature Methods有一篇题目为"Mass spectrometrists should search only for peptides they care about"的文章。乍一看，和我们通常建议的当搜索某一物种或在全库中指定物种搜索时最好加入常见污染蛋白序列的说法大相径庭。
文章研究与疟疾有关，样品同时包含人和疟原虫蛋白，如果只对疟原虫蛋白感兴趣的话，在固定FDR的情况下，只搜索疟原虫数据库会使鉴定结果的灵敏度得到提高。
图：混合物种的蛋白鉴定一直以来都不是很容易解决
假设该样品已经经过良好的表征确定并没有什么人源蛋白质有研究兴趣，那这样就可以搜索一个单一的疟原虫数据库了么？
共享肽段问题如何解决？
"… first searching the spectra against a database containing only the irrelevant peptides and eliminating from the data set all spectra that match this ‘garbage’ database with high confidence. The remaining spectra could then be searched against the database of interesting peptides. For stringent FDR thresholds, I believe that this approach is likely to yield slightly better power than the simple strategy proposed here, at the expense of being somewhat more complicated to implement."
以上策略在诸如Mascot这样的分析软件中很容易实现这样的分析，你可以使用Mascot Daemon的 follow-up search功能设定Re-search那些Non-significant结果，同时指定你要分析的目标数据库。
一个很重要的问题需要考虑，即样品数据的复杂程度。如果数据中疟原虫来源的谱图占90%而人源的只有10%，那么搜索疟原虫数据库自然可以提高灵敏度。但是如果其组成是10%的疟原虫和90%的人源蛋白，搜库的灵敏度会如何？
如果我们感兴趣的是牛痘蛋白，那么显然仅仅搜索病毒数据库会得到更好地灵敏度。如果我们感兴趣的是牛蛋白，而我们选择搜索哺乳动物数据库，搜库结果会如何？
我们测试了一个90%牛痘蛋白和10%牛蛋白的数据，同时设定PSM 1%FDR质控，数据库为Swissprot。得到如下结果：
如果我们感兴趣的是牛痘蛋白，那么显然仅仅搜索病毒数据库会得到更好地灵敏度。如果我们感兴趣的是牛蛋白，而我们选择搜索哺乳动物数据库，你会发现灵敏度反而大大下降。具体到某些蛋白来说，我们举如下几个蛋白的例子：
通常来说，如果你能够尽可能的保证正确匹配的序列不被排除在外的话，缩小搜索空间一定会在等同FDR条件下提高灵敏度。如原作者做的，缩小搜索的序列数据库，或者我们通常会做的，降低MS1容差值或者去掉比较低丰度的可变修饰设置。反过来讲，如果你在缩小搜索空间的时候去除了大部分正确匹配的序列信息，那么在等同FDR下，结果的灵敏度则会变差，类似于上面所举的牛痘/牛蛋白的例子。
去除牛痘序列会去掉所有正确PSM中的牛痘相关结果。当数据库变小时，Decoy结果的得分一般也会相应降低，但这会有边际效应。使得当我们需要控制牛蛋白PSM的FDR为1%时，相应的阈值需要提的非常高来去除很大一部分Decoy结果，很明显这样会降低灵敏度。
正确的牛蛋白PSM的Mascot得分在搜索哺乳动物库和哺乳动物+牛痘库时是一样的，而相应的期望阈值expect value（或者是p-value及PEP值）都会在单独的哺乳动物库中得到更好的结果，原因就是相应的搜索空间会小一些。从这个意义上来说，匹配结果是不可靠的。表面上看是因为FDR的评估标准失去了足够的灵敏度。而目前来说，这又是一个普遍接受的质控标准，你想发文章的话，很难让审稿人接受一个高FDR的数据结果。
转自【质谱搜库达人】，仅代表作者观点