关键词：pulse-chase SILAC; ubiquitination; drug side effects; protein turnover

研究思路和成果：来那度胺能够结合其经典底物E3连接酶CRL4CRBN，并促进后者对靶蛋白如IKZF1，IKZF3，CSNK1A1等发生泛素化修饰。考虑到此类免疫调节药物的多效性及其引发的各种副作用（如致畸性和神经毒性等），研究人员推测有其他底物也受之调控。由于常规的泛素化组学对某些E3连接酶底物鉴定效果不佳，作者建立了一套结合脉冲追踪（pulse-chase）和代谢标记SILAC蛋白质组学的技术流程，希望通过分析药物处理前后蛋白代谢周转（turnover）的动态变化来提高检测的灵敏度，更加精确的寻找药物脱靶底物（off-target）。加入药物刺激的同时将细胞培养基从轻标(L)换为重标(H)，在药物处理一段时间后，收集样本进行质谱鉴定，得到的H/L的比值即可作为蛋白turnover程度的指征。

该技术流程在不同的药物处理时间节点（6h，10h，16h）总共鉴定到~6300个蛋白，其中~2800个蛋白在各时间点样本均有定量信息。数据分析表明，CSNK1A1和ZFP91的H/L比值在来那度胺处理后发生显著改变，而且这两个蛋白的半衰期也在药物处理后缩短，暗示来那度胺调控它们的代谢周转或降解过程。药物处理16h后，相比于对照组CSNK1A1的turnover变化最为明显，因此T=16h很可能可以作为单一时间节点实现更加快速高效的脱靶鉴定。

进一步的单时间点（16h）实验同样鉴定到CSNK1A1和ZFP91在药物处理前后蛋白周转发生显著改变，研究人员对同批样本进行了RNA-seq测序，排除了药物引起CSNK1A1和ZFP91的RNA变化的可能性。相对于测定蛋白表达量的定量变化，代谢标记结合蛋白周转能够提高鉴定的灵敏度，有助于寻找常规方法难以捕捉的药物底物。

为了验证质谱鉴定的结果，研究人员开展了生化实验，来那度胺能够使ZFP91表达量下调，而如果抑制了蛋白酶体，这种下调效果即被缓解，表明ZFP91在药物作用下经由泛素化途径降解。通过基因组编辑技术（CRISPR-cas9）敲除来那度胺的经典底物E3泛素连接酶CRL4^CRBN，细胞内的ZFP91表达量不再受该药物影响，表明来那度胺对ZFP91的泛素化调控由CRL4^CRBN介导。

在使用重组蛋白的体外系统（in vitro），CRL4^CRBN能够结合并促进ZFP91的泛素化修饰。ZFP91是一个锌指蛋白，研究人员将其锌指结构域的关键氨基酸突变（H418A），发现ZFP91的H418A突变体与CRL4^CRBN结合能力显著下降，证明ZFP91的418位组氨酸是其与CRL4^CRBN结合的关键氨基酸。这些数据表明来那度胺等免疫调节药物通过泛素化修饰调控了一个新型锌指蛋白ZFP91的降解过程。

总结：越来越多的小分子药物靶向调控底物蛋白的周转（turnover），然而这类药物经常是多效性的，会引发不同程度的毒副作用。在蛋白组层面系统的研究脱靶效应，就能从分子机制上寻找药物副作用的诱因，为设计联合治疗方案及减缓副作用提供依据。来自哈佛医学院的研究人员建立了一套基于脉冲追踪（pulse-chase）原理的SILAC蛋白质组学技术流程(pSILAC)，用来鉴定作用于蛋白代谢的药物的脱靶效应,并证实免疫调节药物沙利度胺(Thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)可以通过激活其经典底物E3泛素连接酶CRL4^CRBN,泛素化调控一种未被报道过的底物，锌指蛋白ZFP91，经由蛋白酶体降解。本研究为探索药物毒副作用的分子机理提供了重要手段。