邹文安
景杰编者按：现代生物学研究已经从细胞水平发展到分子水平，研究人员除了关注细胞水平蛋白质的变化外，往往还关注亚细胞水平的蛋白组成和变化。对于亚细胞区室蛋白的鉴定，经典的方法是要先通过生化手段对这些亚细胞区室进行富集。但是一些亚细胞区室很难进行富集，比如神经突触上的蛋白，这也是阻碍相关领域的进一步发展的原因。 著名学术期刊Cell报道了Broad Institute的Steven Carr（景杰生物的科学顾问）和华人科学家Alice Ting合作，利用空间限制型酶促标记技术对突触蛋白进行标记，然后利用高分辨率质谱对突触蛋白鉴定。最终发现了200多个突触蛋白，并且证明处于兴奋突触上Mdga2蛋白阻止了抑制性突触上的Nlgn2蛋白与兴奋性突触的接触。景杰生物作为全球蛋白质组学与蛋白质修饰领域的领跑者，为您鉴定亚细胞区室蛋白助一臂之力。
研究思路和结论：
目前对亚细胞区室蛋白的鉴定的流程通常是先将亚细胞区室分离，然后利用蛋白质质谱对相关蛋白进行鉴定。但是很多亚细胞区室，比如神经区室很难分离。这篇文章作者首先对突触蛋白进行化学标记。首选通过转基因的方法，将辣根过氧化物酶／HRP和突触定位蛋白融合，之后加入biotin标记的化学试剂BxxP，而HRP可以催化其富集的蛋白被BxxP化学标记，之后将样本裂解，用streptavidin富集biotin标记的蛋白，最后用蛋白质质谱对蛋白进行鉴定（图 1）。
图1，过氧化物酶（HRP）介导的标记法对突触蛋白进行标记。利用基因工程方法将HRP融合到突触膜上，HRP可以催化将化学试剂 BxxP上的biotin基团转移到突触蛋白上。
随后，研究人员还分别鉴定了兴奋性突触蛋白和抑制性突触蛋白。将HRP和兴奋性突触标志蛋白Lrrtm融合，用于鉴定兴奋性突触蛋白； 将HRP和抑制性突触标志蛋白 Nlgn2A或Slitrk3融合，用于鉴定抑制性突触蛋白（图2）。
图 2，利用基因工程方法，将HRP和兴奋性突触标志蛋白Lrrtm融合，用于鉴定兴奋性突触蛋白； 将HRP和抑制性突触标志蛋白 Nlgn2A或Slitrk3融合，用于鉴定抑制性突触蛋白。
为了减少质谱结果中假阳性几率，作者做了定量蛋白质组学，通过和一些对照结果比较，那些富集到的蛋白更有可能是突触特有的蛋白。作者分别做了四个实验组：两个实验组分别是biotin标记兴奋性突触蛋白、抑制性突触蛋白。对照分别是：HRP非专一性定位于突触、没有biotin标记的突触蛋白。最终得到199个兴奋性突触蛋白和42个兴奋性突触蛋白（图3）。随后的蛋白组分的分级纯化以及共聚焦显微镜结果，证明了7个由质谱鉴定的蛋白的确定位于突触（图 4）。
图 3，（B）四个样本组中的蛋白分别用iTRAQ试剂标记，用于定量蛋白质组分析。（B）定量蛋白质组学结果，扣除两个filter组的结果，得到199个兴奋性突触蛋白和42个兴奋性突触蛋白。
图4，（E）通过亚细胞结构分离，对质谱鉴定的7个突触蛋白定位进行验证。（F）synaptosome的分离过程。（G）利用激光共聚焦显微镜验证Notch2定位于突触。
结论：长期以来，那些很难分离的细胞区室（Cell compartment）的蛋白组成是研究难道，例如突触。 这篇文章中，作者对兴奋性突触和抑制性突触的突触间隙进行了蛋白质组学分析，而之前传统的生化手段几乎不可能有效地分离突触间隙。作者空间限制型酶促标记技术，在突触后膜特定蛋白上融合了HRP，HRP可以催化BxxP探针中biotin偶联在附近的蛋白上，利用亲和层析即可对突触间隙蛋白的富集和鉴定。因此作者把HRP融合在了兴奋型突触特异表达的蛋白Lrrmt1/2、抑制型突触特异表达的蛋白Nlgn2A及Slitrk3，实现了对兴奋型和抑制型突触间隙蛋白组的鉴定。这篇文章的亮点在于利用新技术解决了重要的基本生物学问题。
参考文献：
Ken H. Loh,et al.,Proteomic analysis of unbounded cellular compartments: synaptic clefts. Cell . Volume 166, Issue 5, 1295–1307