邹文安
景杰编者推荐： 植物二萜类化合物具有很重要的生理功能，如叶绿素、胡萝卜素等捕色素参与光合作用； 赤霉素、脱落酸、独脚金内酯等植物激素调控植物生理发育。叶绿体是植物二萜类化合物主要合成场所。但是让研究人员始终不解的是，叶绿体中众多二萜化合物共用同一前体（GGPP），那么该前体是如何在不同合成途径中合理分配？日前著名学术期刊PNAS的一篇学术论文给出了答案。领导该研究的是南京大学卢山教授。研究人员在水稻中鉴定到GGPP合成酶（GGPPS）以及与其互作的蛋白GRP。这两个蛋白在叶绿体的类囊体中形成异源二聚体，相比在叶绿体基质中的GGPPS同源二聚体，可以更高效地合成GGPP，以专供叶绿素合成之需。该项研究揭示了植物在二萜代谢合成途径精细调控中新机制。
关键词：
萜类、光合作用、GGPP、类囊体、蛋白质相互作用、质谱
图 1. 植物叶绿体中，二萜前体GGPP参与合成赤霉素（Gibberellins）、胡萝卜素（carotenoids）、脱落酸（ABA）、叶绿素（chlorophyll）等重要生理活性化合物。
研究思路和成果：
萜类化合物（terpenoids）以异戊二烯为结构单元，是自然界中种类最多、结构最为多变的一类化合物。通常根据所含的异戊二烯单元数将萜类分为单萜、倍半萜、二萜和三萜。萜类化合物种类繁多，从胆固醇、叶绿素、甾体激素等生理活性小分子；到薄荷醇、青蒿素、人参皂苷等药理活性分子；再到蛋白质的异戊二烯修饰、以及我们熟悉的天然异戊二烯聚合物---橡胶，萜类的身影可谓无处不在 (图 2)。（第十三届萜类生物学国际会议于2017年7月16-20日在大连举行，景杰公司也应邀参展，让我们相约萜类生物学最高水准的国际会议）
图 2. 植物萜类合成途径，以及代表性萜类化合物：10个碳的薄荷醇、15个碳的青蒿素、20个碳的紫杉醇前体taxa-4(5),11(12)-diene。
植物的叶绿体是重要生理活性的二萜类化合物的合成场所， 如叶绿素等光合色素；赤霉素、脱落酸等植物激素。上述化合物在叶绿体的不同区室中合成，虽然共享同一前体GGPP，但是GGPP在不同合成途径中合理分配是一个未解之谜。
卢山教授课题组一直从事植物萜类代谢调控的研究，在分析水稻基因组时，他们发现 12个被注释为异戊烯基转移酶（prenyltransferase，PTS）的基因。随后克隆上述基因，将这些基因分别融合荧光蛋白，发现有四个基因编码的蛋白定位在质体中，有趣的是其中两个蛋白（GGPPS1, GRP）分布在类囊体上 （图 3）。
图 3. 水稻GGPPS1和GRP蛋白定位于叶绿体内囊体膜。左图，将GGPPS1和GRP分别融合YFP蛋白，结果表明上述蛋白定位于叶绿体中。右图，免疫印迹分析GGPS1、GRP在叶绿体的亚细胞定位。
接下来的生化实验表明，GRP并没有催化合成GGPP的活性，虽然GGPPS1可以催化合成GGPP，但是特异性不是很高，除了主要产物GGPP外，还有一些副产物如FPP的产生。有报道表明GGPPS可以通过结合GRP而增加其对底物识别的特异性。本文的研究人员将GRP和GGPPS混合后，发现所有底物都被特异性地转化为GGPP。这表明虽然GRP自身没有催化活性，但是可以提高GGPPS1的反应特异性和催化速度（图 4）。
图 4. 利用LC/MS检测体外表达GPPS1、GRP的异戊烯基转移酶活性。
随后作者用体外生化实验（Pull-down）、体内的双分子荧光互补实验（BiFC）证实了GGPPS1和GRP间的相互作用。最后还通过X-衍射的方法解析了GGPPS1同源二聚体和GGPPS1／GRP异源二聚体的晶体结构，两类二聚体在晶体结构上高度类似。蛋白相互作用分析表明，异源二聚体的结合能力强于同源二聚体 （图 5）。
图 5. GPPS1同源二聚体和GPPS1／GRP异源二聚体的晶体结构图。
水稻叶绿体内囊体内叶绿素中的异戊烯基源于GGPP，因此本文作者猜测类囊体中GGPP合成限制因子可能就是GRP和GGPPS1异源二聚体的含量。为此，作者设计了遗传学实验来验证此猜想。他们分别构建了GRP和GGPPS1转基因水稻，然后分析转基因水稻中叶绿素、类胡萝卜素等二萜类色素的含量、GRP和GGPPS1蛋白的水平。结果表明这两个基因水平和上述色素含量呈正相关，并且GRP过表达的转基因水稻中，类囊体膜结合的GGPPS1含量也是显著增加 （图 6）。因此，本文的结果表明，水稻GRP蛋白通过和GGPPS1形成异源二聚体，影响了GGPPS的亚细胞定位，从而精细控制二萜合成前体物质GGPP的流向，使得众多以GGPP为前体的代谢途径并行不悖、井然有序 。
图 6. 左图，转基因水稻表型。 RNAi转基因水稻RNAi#GRP中叶片中叶绿素含量降低，叶片偏黄。右图，过表达GRP的水稻中，类囊体膜上的GGPPS1蛋白含量显著增加。
萜类代谢调控领域的著名学者，中国科学院院士陈晓亚对本文的成果作出中肯的评价，他认为这项研究发现了水稻叶绿体中的一个新的蛋白GRP，它犹如一个向导，将叶绿素合成的关键酶带到叶绿体中的特殊结构（类囊体）中，进而高效地将底物转化为叶绿素，从而保证这个重要的反应不受其它代谢过程的干扰。细胞代谢是一个复杂的网络，有许多分支，轻重缓急各不相同，但光合作用是叶绿体的主业。GRP蛋白的发现很好地解释了植物对叶绿素合成的保障机制。水稻是重要的粮食作物，本研究对农作物生产也具有重要意义。
本论文的工作得到国家重点基础研究发展计划(973)的支持，研究人员来自南京大学、南京农业大学、上海交通大学、中科院上海植物生理生态研究所以及美国普渡大学。南京大学博士生周飞和卢山教授分别为本文的第一作者和通讯作者。
卢山博士，南京大学生命科学学院教授。博士毕业于南京大学，先后在中科院上海植物生理生态研究所、德国马克斯普朗克研究所、美国康奈尔大学等著名研究机构从事博士后研究工作。卢山博士专注于植物单萜、类胡萝卜素类二萜化合物代谢调控的研究，相关成果发表在PNAS、Plant Cell、Plant Physiology等著名学术刊物。
参考文献：
Fei Zhou, et al. A recruiting protein of geranylgeranyl diphosphate synthase controls metabolic flux toward chlorophyll biosynthesis in rice, Proc Natl Acad Sci USA,2017
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