邹文安
景杰编者按：和基因相比，蛋白质才是生物功能的直接执行者，绝大多数的疾病都和蛋白质的异常相关。在疾病的研究中，如何寻找和疾病相关的异常蛋白一直是研究的重点。之前的生物学研究往往采取reverse的策略，通过表型的异常来寻找对应的基因异常，再去确定异常的蛋白。但是这种策略不够直接，效率较低；定量蛋白质组学则提供了另一种研究策略，通过forward的策略去寻找和疾病相关的异常蛋白，可以更高效的寻找这些异常蛋白或者蛋白质修饰的异常。Label-free、TMT/iTRAQ和SILAC是三类主要的定量蛋白质组学方法，各有其适应范围。目前很多科研工作者在定量蛋白质组学方法的选择上有疑惑。为此景杰生物近期推出一系列评测文章，通过实例分别介绍每种定量方法的特点和适应范围，以飨读者。景杰生物作为全球蛋白质组学及蛋白质翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。
关键词：定量蛋白质组学、TMT、iTRAQ、Label-free、SILAC非标定量
定量蛋白质组学的经典的方法是Label-free/非标定量。该方法无需对蛋白样本进行标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的质谱响应信号，便可得到样品间蛋白表达量的变化。相比之下,目前风头最盛的定量蛋白质组学技术非TMT/iTRAQ莫属。分别用含稳定同位素的试剂在体外标记样本酶解后的肽段，随后将样本混合后进入蛋白质质谱分析。TMT/iTRAQ技术可以带来非常丰富的定性定量数据，并且能够实现高度的分析平行性，最后的定量结果要较Label free要可靠。
分析一下Label free定量技术的难点，主要是体现在肽段分级和最终蛋白定量准确性间的矛盾。所谓肽段分级就是利用高效液相色谱将一份样本分为多份样本（常说的分4个组分，即通过分级的方法将每份样本分为4份），每一个组分再分别进行LC-MS分析（即4个组分，共进行4次LC-MS分析）。分级后每一个组分的样品复杂度比原始样本大大降低，从而可以提高质谱对样本中肽段的鉴定覆盖度和深度。但是对Label free而言，如果不对肽段分级，最终质谱鉴定的蛋白通量低；一旦分级后，最终蛋白定量准确性差。因此考虑到定量准确性，Label free技术一般不进行分级。
然而在某些情况之下，比如要分析样本中蛋白有无的关系时，这种时候就需要使用Label free技术了。面对难题，景杰公司的研究人员凭借着对蛋白质组学技术的深刻理解，成功地解决Label free分级定量不准的技术难题。
景杰公司完全可以实现多组分分级的Label free技术服务，且不会对蛋白定量准确性产生明显影响。当然，这年头高调是需要拿实力说话的，看看PTM-Biolab为Label free分级稳定性做得测试实验！
实验设计如下：
某动物组织，对照组（control）和实验组（experiment），每组3个重复，分别进行6个组分，每个组分进行1hr质谱分析。
有图有真相，来看结果：
鉴定到的蛋白质数量：6500+
定量到的蛋白质数量：5000+
鉴定到的肽段数量：50000+
差异蛋白表达数量（ratio>2，且p value <0.05）：600+
从三次重复的散点图以及Pearson相关系数可以发现，三次重复性非常好！
图1. 为了更好的度量两个随机变量的相关程度，引入了Pearson相关系数，其在协方差的基础上除以了两个随机变量的标准差。Pearson是一个介于-1和1之间的值，当两个变量的线性关系增强时，相关系数趋于1或-1。当相关系数大于0时，表明它们之间是正相关；当相关系数小于0时，表明它们之间是负相关；当相关系数等于0时，表明它们之间不存在线性相关关系。
为了增加实验设计的严谨性，在蛋白酶解前分别往样本中加入等量的标准蛋白（两个外源标准蛋白），以此进一步考察Label free技术的定量稳定性。从标准蛋白在每个样本中的强度来看，均在1左右，符合预期。进一步表明Label free技术的定量稳定性。
图2. 标准蛋白在各组中的强度
讲到这里，TMT/iTRAQ表示不服，我们来计算一下实验成本：
Label free 分级（6个组分）：2组*3重复*6组分*1 hr=36 hr
TMT-6plex 分级（18个组分,具体组分数目是否是公司的机密？）：1标记（2组*3重复）*18组分*1 hr=18 hr
可以看到，TMT定量技术可以大大减少LC-MS的分析次数，以此减少实验周期和成本（TMT比Label free少一半左右）。
TMT/iTRAQ逆袭成功，但是很有底气的Label free表示：你有你的生活，我有我的远方。给个图，自己体会。
图3. 两种方法的优先选择情况分析
务必注意：Label free分级的实现，保证分级过程中的平行性是重点。否则，在每个样本都进行大规模分级的过程中，不平行性会导致定量的准确性。分级有风险，请选择专业蛋白质组分析机构——景杰生物。
景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。
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