Science：磷酸化组学揭示大脑中阿片类药物受体信号通路

景杰生物/报道

对于现代新药研究与开发，关键首先是寻找、确定和制备药物筛选靶标。G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor, GPCR)超家族是神经性疾病的主要药物靶标，系统性研究GPCR在体内的信号转导对于低副作用GPCR疗法的发展相当重要。阿片类药物具有强效镇痛的作用，但短时间内即可产生成瘾等副作用。研究药物在大脑中激活的细胞信号级联反应，有助于药物的开发与优化。

近期(6月22日)，国际著名学术杂志Science报道了来自德国马克斯-普朗克生物化学研究所（MPIB）、奥地利因斯布鲁克医科大学等的科学家合作发表的研究成果，研究者应用高通量磷酸化蛋白质组学分析了小鼠大脑内5个不同区域对阿片类药物作用后产生的信号通路，为理解大脑中阿片类受体信号通路建立方法。

关键词：磷酸化蛋白质组学、GPCR、信号转导

1、样本选择与制备

为了解阿片类药物在大脑内产生的信号通路及药物发挥作用的方式，以阿片类受体（KOR）为模型，研究人员首先在小鼠脑内注射5种不同的KOR激动剂，在作用5min和30 min后，解剖了大脑的五个不同区域，包括有表达KOR的纹状体、海马体、大脑皮层、髓质和没有KOR表达的小脑。

2、磷酸化组学分析，研究不同区域信号通路

研究人员采用Label Free的磷酸化修饰组学方法，对这5个不同区域的样本进行研究。共鉴定到约6700个脑内蛋白上的60,000多个磷酸化位点。这是到目前为止已报道器官磷酸化组学中覆盖最全面的研究，也表明了磷酸化调控在大脑内的多样性和重要性。

 图1 Label-Free高通量磷酸化组学技术路线

研究者采用高通量磷酸化蛋白质组学的方法研究了小鼠脑部5个区域内由不同结构的激动剂诱导产生的信号转导。

1.小鼠脑内磷酸化蛋白质组架构

为获取小鼠大脑内磷酸化组学的综合情况，研究人员对未受刺激的小鼠脑部区域磷酸化蛋白质组结果进行了PCA分析，结果显示每个脑部区域的磷酸化蛋白质组紧密聚集，这表明每个大脑区域都有各自特异的磷酸化蛋白质组。

此外，区域间相似的发育起源在磷酸化蛋白组中也体现出了相似性。motif富集分析表明激酶表达水平与磷酸化肽段丰度具有显著相关性，反映出不同大脑区域内的蛋白质组和激酶部分地参与磷酸化蛋白质组的形成，同时可以观察到85%的突触蛋白具有磷酸化修饰。

图2未受刺激的小鼠脑部磷酸化蛋白质组学分析

通过大规模捕获磷酸化蛋白质组，研究人员获得可定量磷酸化位点50,000多个，同时获得了大脑样品中所有有活性的信号通路图谱。在U-50,488H激动剂作用5 min后，研究人员发现在纹状体中有1000多个位点发生了变化，这表明药物对大脑中的信号通路具有全局性的影响。同时，研究人员还观察到五个大脑区域内受调控的磷酸化位点数目变化依次是：纹状体>海马体>大脑皮层>髓质，与KOR在各个大脑区域内的表达水平一致。而在小脑内并没有检测到KOR表达，也几乎没有任何受调控的磷酸化位点。同时，研究人员还对敲除了KOR的四个脑部区域进行位点检测，没有发现受调控的磷酸化位点，说明了大脑内配体作用的特异性。综上表明磷酸化蛋白组学能够观测到大脑内特定区域受KOR调控的信号通路。

 图3 U-50,488H诱导调控小鼠脑内5个不同区域磷酸酸化水平

2.KOR信号通路具有脑部区域特异性

对激动剂处理组的磷酸化蛋白质组结果进行PCA分析，结果表明U-50,488H影响最深的分别是纹状体早期时间点和大脑皮层晚期时间点。纹状体是中脑缘通路的一部分，大脑皮层是中脑皮层通路的一部分，这两个是KOR信号通路中最为突出的（也反映出这两个区域中比较高的KOR水平），由此发现U-50,488H介导的KOR信号通路具有高度的区域特异性。

 图4特定区域内U-50,488H诱导激活KOR

3.纹状体突触磷酸化蛋白质组中的KOR信号通路

研究人员对KOR介导的突触蛋白的磷酸化动态变化进行了系统性分析，发现U-50,488H、HS665和RB64之间表现出较大的相似性，而不同于6’GNTI和HS666，说明了在系统磷酸化水平上研究体内GPCR信号通路分子基础的重要性。这些分析结果表明神经系统中不同信号通路差异调控具有复杂性和微妙性。

图5 KOR介导突触中的信号通路（激动剂作用5 min后）

4.磷酸酶参与U-50,488H介导的KOR信号通路 

为检验“U-50,488H会特异性激活丝/苏氨酸的磷酸酶”这一假设，研究人员给小鼠注射了三种不同功能性的磷酸酶抑制剂：fostriecin，calyculin，tautomycetin。在达到作用时间后，将纹状体做磷酸化蛋白质组学分析。结果与假设一致，有300个磷酸化位点在有至少一个磷酸酶抑制剂的情况下发生了去磷酸化，这证明磷酸酶在U-50,488H介导的信号通路中具有重要作用，同时发现磷酸酶敏感性位点中几乎一半属于突触蛋白，这也表明磷酸酶在突触蛋白功能中的重要性。

图6 PP2A介导U-50,488H行为

5.抑制mTOR通路消除药物带来的恶心反应

本文是对大脑接收阿片类药物后产生止痛等效果的信号通路激活的研究，与此同时，其他信号通路的平行激活也会导致不良副作用产生。研究人员发现雷帕霉素(mTOR)通路的机制靶点被U-50,488H富集，而U-50,488H会导致典型的由KOR介导的副作用-恶心。因此，在KOR激活过程中，抑制mTOR通路可以消除恶心这一副作用，而同时药物可以正常发挥镇痛和抗惊厥的作用。

本研究结果建立了采用高通量磷酸化蛋白质组学来分析体内GPCR信号通路的方法，通过这种方法我们可以系统性地了解药物的影响，从而针对性地干扰级联信号以达到减弱或消除副作用的目的。与此同时，作者的研究也让我们看到了磷酸化蛋白质组学在新药设计和开发中的应用价值。

景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，提供领先的高通量磷酸化修饰组学方案，以一站式蛋白质组学及修饰组学解决方案与高灵敏度的修饰类抗体，满足各类研究需求。

参考文献：

1.Liu, J. J., et al., 2018, In vivo brain gpcr signaling elucidated by phosphoproteomics. Science.