Nature Communications:高通量磷酸化修饰定量技术大起底

景杰生物/解读

编者按：磷酸化是生物体中普遍存在的蛋白质修饰类型，在包括信号转导、代谢调节、免疫调控等各个方面都有极其重要的功能和作用。基于质谱的高通量蛋白质组技术的发展，无疑为磷酸化的鉴定和定量分析提供了强大的工具，极大拓展了人们对于磷酸化修饰的认识。然而，质谱定量技术的发展层出不穷，包括LFQ（label-free quantificaiton）、TMT、SILAC等各种技术都可以用于磷酸化修饰的定量分析。那么，这些技术各有什么优缺点，在具体应用的时候又应该如何抉择，则是一个见仁见智的问题。那么，是否能通过一个严格的比较实验，来提供一份科学的依据呢？

近日，丹麦哥本哈根大学的研究者在Nature Communications上发表了他们最新的研究报道（图1），将LFQ、TMT和SLAC技术应用于磷酸化的分析做了详细的比较，结论是label-free和SLAC具有更好的精确度（accurancy，即测量值和真实值之间的差距），而TMT技术则有更好的精密度（precision，即表示测量的再现性）。作者认为一般的科研实践中，更重要的是稳定和可重复的结果，因此更推荐精密度占优的TMT定量方法。

研究结果

目前主流的质谱定量方法，分为LFQ、SILAC和TMT几类，三者的原理各不相同。其中：LFQ技术采用的是非标记定量，灵活方便，但其相对较大的随机性误差乃是其固有缺陷。SILAC技术一度被誉为质谱蛋白定量的“金标准”，然而其对同位素试剂的依赖性则大大限制了其应用范围。TMT技术是标签定量技术的主流方法，常规的MS2二级定量方法有较好的定量重复性，但其比值压缩效应会造成结果的失真，因此哈佛大学的Steven Gygi教授开发了基于MS3三级定量的TMT方法，能够部分解决这个问题。这些理论方法，都已为业界所共识。然而在具体实践中，到底这些优缺点的权重如何？到底哪个才是当前的最优性价比的方法？要回答这些问题，需要一个完善的科学实验来回答。

在这篇文章中，研究者采用相同的酵母和细胞材料，对这三种方法进行了详细比较（图2a）。结论是，在定量精确度（accurancy）方面，LFQ方法有最好的表现， SILAC方法次之。而TMT由于比值压缩效应，对真实的定量数值有严重的低估（低估程度达到2-3倍）。而如果采用MS3三级定量的方法，能够有效缓解这种低估，但会造成检测通量上的损失（图2b）。然而在精密度（precision）方面，TMT则具有非常显著的优势，由于其标记后混合以及平行上机的方式，比其他方法的重复性和稳定性都更优。

那么，既然技术上各有千秋，那么这些方法在揭示生物学问题方面的表现如何呢？作者使用了一个DDR的药物处理细胞模型作为材料，通过比较，发现MS2的TMT方法能够最有效的发现生物学有意义的差异。这得益于其较高的检测通量和更好的平行性。这意味着尽管TMT的技术会造成定量比值的压缩，但是对一个生物学实验的高通量筛选来说，“检测到显著的差异”比“到底是几倍的差异”更重要。

作者在之后的Discussion部分对这些方法做了评述和回顾，认为尽管在精确度（accurancy）上有所欠缺，但是基于MS2的TMT方法仍然是一般生物学应用中首先推荐的磷酸化组学定量方法。作者也提到了现今火热的DIA技术，认为该技术如果能有效解决修饰鉴定的可靠性问题，也将是一个非常值得期待的方法。