“物固无常宜”--磷酸化组学揭示CAR信号传导对细胞功能的影响

ScienceSignaling：CAR信号传导对细胞功能有什么影响？磷酸化组学为您揭晓

邹文安邹文安2025-07-02
“物固无常宜”--磷酸化组学揭示CAR信号传导对细胞功能的影响

景杰生物/解读

研究对象：嵌合抗原受体

样本：CAR-T细胞

技术：TMT定量磷酸化组学

发表期刊：Science Signaling

发表单位：美国弗雷德哈钦森癌症研究中心

发表时间：2018. 08

关键词：嵌合抗原受体，质谱，磷酸化，TMT，信号强度


编者按：随着基因工程技术的发展以及人们对T细胞识别认识的提高，肿瘤靶向受体-嵌合抗原受体（CAR）应运而生，因此也有了将CAR转染至人的T细胞从而增强过继免疫治疗的抗原识别特异性和杀伤功能的技术。模拟T细胞信号级联的合成受体也是目前正在进行开发的免疫治疗试剂。目前在临床研究中常用第三代嵌合抗原受体，即CAR不仅包含CD3z 信号域，还包括两个共刺激信号分子CD28和4-1BB。

为了研究CD28/CD3z 和 4-1BB/CD3z 信号强度对细胞功能的影响，美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的研究者们运用定量蛋白质组学技术分析了不同时间，不同信号强度对效应细胞功能的影响，提供对CAR信号的重要信息，为下一代CAR设计提供了方向及启发。该研究成果于近期发表在国际专业学术期刊Science Signaling上。

 

研究速读


1.含有Strep-tag II序列的CAR能够选择性激活原代T细胞中的CAR信号传导

为了使人类的原代T细胞更适合研究CAR信号转导，研究者开发了一种激活T细胞中CAR信号转导的方法，即就是在细胞外CAR添加9个氨基酸的Strep-tag II(STII)序列(图1A),该序列不会干扰CAR-T细胞的识别功能，并且STII CD28/CD3z 和4-1BB/ CD3z CAR-T 细胞在体外模拟可以进行有效的激活和扩增（图1B）。

Fig. 1. Both CD28/CD3z and 4-1BB/CD3z CAR-T cells can be activated through an engineered STII hinge.

2.刺激CD28/CD3z or 4-1BB/CD3z CAR-T细胞的磷酸化组学分析

将刺激的CD28/CD3z or 4-1BB/CD3z CAR-T细胞（实验组）与对照组一起孵育10min和45min(图2A)。利用TMT标签进行标记，通过酪氨酸磷酸化免疫沉淀和IMAC全面富集磷酸化肽段，最后共鉴定到26,804个磷酸化位点，其中571（2.13%）个是酪氨酸磷酸化位点（pTyr），4647（17.33%）个是苏氨酸磷酸化位点（pThr），21,586（80.53%）个是丝氨酸磷酸化位点（pSer）（图2C）。所有的CAR-T细胞在10分钟后显示在Tyr209处CD28的磷酸化增加，这证明4-1BB/CD3z CAR活化刺激内源性CD28的磷酸化。刺激45分钟后，Ser1248上磷脂酶C–g1 (PLC-g1) 和Ser138上BCL10的磷酸化增加(图2E) 。

Fig. 2. CAR-T cells signal through endogenous T cell signaling proteins.

3.CD28/CD3z与4-1BB/CD3z CAR信号传导的强度差异持续存在

由CD28/CD3z 和 4-1BB/CD3z激活CAR-T细胞的磷酸化强度趋势相似，但大多数发生部位的强度不同。在处理45min时研究者从CD28/CD3z 和 4-1BB/CD3z CAR样本中分选出响应磷酸化刺激的位点，结果显示两种CAR刺激改变相似磷酸化位点的结果一致，刺激后的20个磷酸化位点中有15个在CD28/CD3z 和 4-1BB/CD3z CAR-T细胞之间共享 。

研究小结

CD28/CD3z or 4-1BB/CD3z CAR-T细胞的过继转移对某些B细胞恶性肿瘤患者是一种有效的治疗方法，但是在肿瘤细胞识别后可能会引起严重的CAR信号传导毒性，由于CD28/CD3zor 4-1BB/CD3z CAR信号传导作用会影响细胞的功能，那么制定更安全更有效的CAR是今后的研究焦点，因此质谱分析可以提供对CAR信号的重要信息，这些重要信息将会影响下一代CAR设计。

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参考文献：

Salter AI, et al. (2018) Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling.




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