Oncogene | 蛋白质组学识别EGFR靶向治疗癌症的效应传感器

景杰生物 | 解读

●研究对象：癌症中粘蛋白1（MUC1）

●疾病和样本：乳腺癌和非小细胞肺癌样本

●发表期刊：Oncogene

●发表时间：2018年9月

●关键词：蛋白质组学，效应传感器，肿瘤标志物，MUC1，EGFR抑制

景杰编者按：2018年9月12日，CA出版了最新的全球癌症发病率及死亡率的统计，2018年将有1810万新发癌症病例和960万癌症死亡病例（CA发布2018最新全球癌症发病率及死亡率统计）。癌症是全世界每个地区发病率和死亡率的重要原因。面对日益高发的癌症，癌症的早期诊断与精准治疗变得越来越重要。

近年来评估肿瘤对药物治疗的反应主要根据RECIST 1.1标准，每2-3个月测量一次肿瘤肿瘤大小及密度变化[1]。这种反应可能需要几个星期到几个月才能显现出来，因此不适合对抗癌药物的疗效进行早期评估。该标准在联合治疗的早期试验中，通常很难确定新药物治疗的最佳时间、持续时间和疗效[2]。因此，更多的药物特异性的药物疗效观察可能会改善对肿瘤反应的评估，以指导临床决策，改进研究设计及减少不必要的药物暴露。

当一种药物特异性肿瘤效应指标可以被非侵入性和重复地测量，便能够评估单个药物的贡献，从而提供一个效应传感器[3]。理想情况下，效应传感器是动态的标记物，既可以在肿瘤细胞中检测，也可以在被肿瘤细胞释放的循环标记物中检测到。多种互补方法已被用于非侵入性评估动态生物标志物，包括循环生物标志物和肿瘤生物标志物的分子成像等。肿瘤生物标志物也可以通过分子成像进行可视化，具有测量病变间异质性的能力[4]。然而，目前还没有通过分子靶向制剂动态测量肿瘤细胞成功靶向的生物标记物。

近日，国际专业学术期刊Oncogene发表了蛋白质组学运用于肿瘤标志物筛选相关领域的研究。该文关注表皮生长因子受体(EGFR，多种癌症类型的致瘤因子)靶向治疗的效应传感器的发现和验证。以EGFR为靶点的治疗药物，基于蛋白质组学，在人乳腺癌和肺癌模型中检测了EGFR抑制剂Erlotinib对早期蛋白动力学的反应，发现MUC1可作为一种效应传感器，用于监测EGFR靶向效应，该效应可以通过连续的血液采样在体内进行非侵入性监测[5]。

全蛋白质分析非常适合于发现药物特异性蛋白表达效应，可作为识别效应传感器的通用工具。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。

文献精读

为了鉴定可以作为EGFR抑制效应传感器的蛋白，研究者检测了5个EGFR野生型的人类乳腺癌细胞系对EGFR抑制剂Erlotinib的反应。结果表明SKBR3、SUM149和 BT474细胞系对Erlotinib敏感，而MB-MDA - 231和BT549对其不敏感(图1)。

图1 筛选对Erlotinib敏感的人类乳腺癌细胞系

接下来研究者们对Erlotinib敏感的细胞系进行了蛋白质组学分析，采用SILAC标记定量法检测SKBR3、SUM149和BT474细胞系中蛋白质组差异。在这三个细胞系中分别鉴定到2131、2120和1787个蛋白，其中有1305个共同表达的蛋白。通过GO注释鉴定出621 (47.58%)个膜蛋白，228(36.71%)质膜蛋白（图2）。

图2 Erlotinib抑制乳腺癌细胞系的全蛋白质组分析

在差异表达的蛋白中，Erlotinib处理后PCNA 和CDK1表达明显下降，与EGFR失活引起的G1细胞周期阻滞结果一致。后期验证发现MUC1和ACSL1重现了上调反应，但只有MUC1的mRNA和蛋白质水平对Erlotinib处理的反应是一致的。值得注意的是，MUC1的蛋白表达是Erlotinib剂量依赖性的。MUC1由胞外的MUC1-N和膜及胞内的MUC1-C组成，并且可以在血浆中检测到，是一种潜在的效应传感器。

图3 MUC1是一种潜在的效应传感器

2. 多个EGFR靶向治疗策略上调MUC1表达

由于Erlotinib被用于EGFR突变的非小细胞肺癌患者的临床治疗，作者接着研究MUC1上调是否也发生在wt-或mutant-EGFR 非小细胞肺癌细胞系中。HCC827(EGFR19号外显子缺失)和H292(wt-EGFR)细胞系在Erlotinib中处理下MUC1显著上调，而EGFR野生型细胞系（Calu-3和H441）的MUC1上调相对较小(图4d)。而在Erlotinib非敏感性NSCLC细胞系（H322 和A549）中MUC1的表达并无上调，耐Erlotinib的HCC827突变系（HCC827-R）中MUC1亦无上调。EGRR及HER家族的其它靶向药物试验在SUM149和SKBR3细胞系中MUC1也表现出上调反应（图4e）。综上，MUC1的上调是特异性的针对EGFR的失活，而不是对抑制增殖或细胞应激的一般反应。

 图4 验证MUC1特异性对EGFR失活做出反应

3. Erlotinib诱导MUC1的表达需要PI3K/AKT/mTOR信号通路

细胞信号通路的重新连接可以逆转EGFR抑制下游信号通路的作用。例如，HER3和c-MET受体之间的相互作用增强了Erlotinib对非小细胞肺癌细胞的抑制作用。GSEA富集分析显示KRAS/ERK和AKT功能的改变影响了基因的富集（图5A）；抑制MEK (AZD6244)或ERK (FR18024)，单独或联合Erlotinib均不影响SKBR3细胞中MUC1的表达水平。相比之下，即使没有EGFR的抑制，抑制PI3K (BEZ235)、AKT (MK2206)或mTOR (everolimus)也可以有效降低SKBR3细胞中MUC1的表达 (图5B)。

 图5 PI3K/AKT通路诱导MUC1表达

为了进一步确定PI3K/AKT通路是如何参与诱导MUC1表达的，研究者分析了Erlotinib处理后SUM149和SKBR3细胞中该通路的下游信号通路。结果表明PI3K结合Erlotinib处理可抑制AKT和S6的磷酸化，并干扰SKBR3和BT474细胞中MUC1的表达，而在SUM149细胞中很少产生这些效应（图6 C）。这些结果表明，在Erlotinib处理的SKBR3和BT474细胞中AKT/MTOR代偿激活支撑了MUC1的表达，而其他代偿过程可能是SUM149细胞中MUC1表达的基础。

 图6 Erlotinib通过PI3K/AKT/mTOR信号诱导MUC1的表达

4. JAK2/STAT3驱动EGFR失活的肿瘤细胞中MUC1表达

研究者使用GSEA寻找转录因子(TF)，其靶基因在蛋白质组数据集中富集，并发现了已知的MUC1表达调控因子STAT和SP1的富集（图7d）。sirna介导的STAT3缺失导致Erlotinib诱导的MUC1- n和MUC1- c的表达均降低，说明在这种情况下确实需要STAT3来驱动MUC1的表达（图7e）。然而,STAT3损耗SKBR3细胞并不影响MUC1 MUC1的表达表明其他转录监管机构参与其上调。有趣的是,PI3K抑制siLUC处理的 SUM149细胞减少STAT3的表达,并结合失活PI3K和可拆卸的STAT3进一步降低Erlotinib处理的 SUM149细胞中MUC1表达。JAK2抑制剂bms – 911543抑制SUM149细胞中Erlotinib诱导的MUC1的表达（图7f）。因此, 在EGFR抑制的SUM149细胞中，JAK2 / STAT3通路可能通过PI3K / AKT的交互/ MTOR信号通路参与调节MUC1的表达。

 图7 验证 JAK2/STAT3驱动EGFR失活的肿瘤细胞中MUC1表达

5. 活体内检测MUC1作为EGFR抑制的效应感应器

为了验证活体内MUC1的表达是否在Erlotinib处理下上调，研究者用一系列浓度的SUM149诱导的肿瘤小鼠，检测MUC1的表达。IHC分析显示MUC1表达升高，而对照组小鼠MUC1的表达水平低至忽略不计（图8c）。分子成像技术结果显示Erlotinib处理组和对照组之间MUC1水平的观察结果并无显著差异（图8e），但一起进行的血液样本的检测结果显示Erlotinib处理组血浆中MUC1的水平较控制组显著升高（图8f,g）。这些结果表明检测ctDNA中的MUC1可以应用于Erlotinib治疗反应的早期监控。

图8. 活体内检测MUC1作为EGFR抑制的效应感应器

小结与讨论

研究人员使用基于质谱的蛋白质组学方法在乳腺癌检筛选可以作为EGFR抑制效应传感器的蛋白；并通过在乳腺癌和肺癌中验证了MUC1的蛋白表达依赖Erlotinib剂量，是一种潜在的效应传感器；MUC1的上调是特异性的针对EGFR的失活，而不是对抑制增殖或细胞应激的一般反应。

通过进一步GSEA分析表明Erlotinib诱导MUC1的表达需要PI3K/AKT/mTOR信号通路，JAK2 / STAT3通路可能通过PI3K / AKT的交互/ MTOR信号通路参与调节MUC1的表达。最终得出ctDNA中的MUC1可以应用与Erlotinib治疗反应的早期监控。

目前人们把相关的基因或蛋白产物作为肿瘤标志物,而且已经广泛认识到通过联合使用肿瘤标志物来获得更多临床信息,但是这对于癌症早期诊断以及个体导向治疗、结果预测等方面是远远不够的，通过诊断技术的革新能够发掘更多的控制癌症发生、生长的肿瘤标志物。

研究说明以蛋白质组学为代表的组学研究，对于临床病理诊断的重要意义。蛋白质组学的研究能为多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径，真正意义上实现疾病“精准治疗”无论在机制研究还是临床应用中“精准”的需求。

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