Nat Commun | 西南医院团队报道小鼠肝脏昼夜节律的多修饰组学图谱

景杰生物 | 报道

肝脏生物钟与进食周期（Meal Timing）紧密相关。研究发现日间/睡眠时间限制进食（day/sleep time-restricted feeding, DRF）可在7天内逆转肝脏生物钟。目前，越来越多研究表明蛋白质翻译后修饰（PTMs）驱动着肝脏蛋白质组的日常节律。其中蛋白质磷酸化、泛素化、乙酰化等是控制生物钟的重要PTMs。肝脏中25%以上的磷酸化位点和40%以上的蛋白质的磷酸化修饰表现出昼夜节律振荡。蛋白质泛素化修饰在肝脏中呈现昼夜节律变化，影响了脂肪酸氧化、葡萄糖代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路的信号传导。此外，蛋白质乙酰化修饰主要存在于线粒体蛋白质中，并且受到夜间/清醒时间限制性进食（night/wake time-restricted feeding, NRF）的调控。其他PTMs，如琥珀酰化和N-糖基化，也分别发挥着调控线粒体和肝脏分泌的功能。然而，目前关于限时进食（time-restricted feeding, TRF）过程中蛋白质和PTMs调节的系统认识还较缺乏，需要更深入的探究。

近日，西南医院李旻典和张志辉教授团队在Nature Communications (IF=16.6)上在线发表了题为“Multi-omics Profiling Reveals Rhythmic Liver Function Shaped by Meal Timing”的最新研究成果[1]。该研究针对两种不同的饮食模式，即恢复代谢健康的活跃期限制进食和提高运动耐力的静息期限制进食，结合蛋白质组学、4种主要翻译后修饰修饰（磷酸化、泛素化、糖基化与琥珀酰化）和脂质组，绘制出不同限制进食模式下的小鼠肝脏昼夜节律多组学全景式图谱。

李旻典和张志辉课题组以往的研究证明了在雌性小鼠中，肝脏的时钟和转录组能够受到DRF的影响而对其进行调节，但代谢组不会受到影响。因此，肝脏中转录组和代谢组反应之间的差异让研究人员不禁提出一个疑问：蛋白质组水平上每日节律的变化对于限时进食期间肝脏（至少在雌性中）的昼夜生理学是否至关重要？此外近年来，越来越多的研究意识到昼夜节律稳定性方面的性别差异。在哺乳动物中，雌性比雄性更能维持运动、内分泌系统、细胞代谢和基因表达的昼夜节律。与雄性相比，雌性在DRF期间表现出更大的非肝外周振荡器的昼夜节律巩固。然而，肝脏的节律和转录组及两性都表现出相似且完全符合DRF的同步化适应功能。因此，研究人员采用雌性小鼠的肝脏作为模型来揭示昼夜节律相对于相位调节的精细调节。

为了系统性地探索进食时间调节的肝功能节律，作者将小鼠分成白昼限时进食（DRF）和黑夜限时进食（NRF）两组，在处理一周后的48小时内每隔4 小时收集一次组织，进行蛋白组、4种翻译后修饰组（磷酸化、泛素化、琥珀酰化和N-糖基化）及脂质组定量分析。进一步的组学分析表明，34.3%的蛋白质、44.8%的磷酸化蛋白、37.8%的泛素化蛋白、15.7%的N-糖基化蛋白以及1.9%的琥珀酰化蛋白在TRF雌性小鼠的肝脏中呈现出节律性。以上数据表明，在这四种PTMs中，磷酸化对营养的反应最灵敏，琥珀酰化最弱。

图1 限时喂养小鼠肝脏的昼夜多组学分析

接着，作者对组学数据进行了深入的生信分析。基于相移的通路富集分析结果显示，大多数节律性通路的相移在4-5小时之间，而富集程度最高的通路，如甘油三酯/胆固醇代谢过程、肽分泌调节和微体，其相移不超过8小时。综合模型表明，生物钟（尤其以磷酸化的PER2为代表）及其在脂肪酸代谢途径中的紧密相关蛋白质是小鼠肝脏响应TRF的关键昼夜节律特征。此外，在展现出节律性的蛋白质和修饰中，其中一部分的振荡模式会在两种进食条件下发生相反转，比如核心生物钟蛋白质PER2的pSer971在在NRF和DRF中都存在振幅较大且相反的昼夜节律。在泛素化修饰组中，响应饮食周期变化的蛋白多数与脂质代谢过程相关。相应地，脂质代谢组中的超过150种脂质也表现出显著的节律性。在综合对比了转录组与蛋白质组数据后，作者发现大部分mRNA和对应蛋白不存在相同的节律特征，而可以相互匹配的数据几乎都有相位延迟。

图2 DRF肝脏的磷酸化组分析

接下来，研究人员将这昼夜多组学数据集与最近发表的昼夜转录组学数据集（GSE150380）进行了比较。通路水平的连接图谱表明，在NRF和DRF下，蛋白质磷酸化和N-糖基化分别作为肝功能昼夜网络的枢纽。最后，作者简单地验证了PER2-pSer971的营养反应活性，通过采用小鼠PER2的pSer971肽抗体进行实验，结果发现PER2 Ser971在肝细胞中内源性磷酸化，其信号在PER2 S971A突变体中被消除。免疫印迹分析显示，PER2-pSer971的水平随着细胞外葡萄糖浓度的升高而升高。以上结论表明PER2-pSer971在体内被营养物质的可利用性激活。

图3 昼夜转录组和多种蛋白及修饰组的综合分析

综上所述，该研究采用两种互补的限时进食方案，结合蛋白组、多种修饰组学及脂质组学技术，创建了肝脏组织在限时进食条件下的蛋白质组学、磷酸化修饰、泛素化修饰、琥珀酰修饰和N-糖基化修饰以及脂代谢的综合图谱，这是迄今为止规模和深度最大的肝脏响应限时进食后代谢反应动态变化数据库( http://www.circametdb.org.cn )。研究还揭示了PER2-pSer971修饰与营养感知之间的关联，为代谢节律的机制研究提供了新的视角，此外多种具有节律性的翻译后修饰蛋白的发现不仅丰富了我们对雌性小鼠限时饮食中节律相关分子的认知，而且暗示了翻译后修饰在代谢节律中可能具有广泛且重要的调控功能。因此，结合这些数据库和代谢感应后的蛋白质修饰及脂代谢产物，有望帮助研究者更深入地理解代谢与昼夜节律之间的复杂关系。

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参考文献：

1. Huang R, et al. 2023. Multi-omics profiling reveals rhythmic liver function shaped by meal timing. Nat Commun.