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慢加急性肝衰竭(ACLF)是一种发生在已经患有慢性肝脏疾病的患者身上，迅速恶化的肝衰竭综合征。慢加急性肝衰竭进展迅速，通常会在几周内出现高黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病等并发症，平均病死率40%左右。因此，准确有效的生物标志物查找对临床上及时进行ACLF患者风险预估与评判至关重要。

浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室李兰娟院士是我国著名的传染病学家，自1986年开始人工肝治疗肝衰竭研究，是我国人工肝事业的开拓者，创建独特有效的李氏人工肝系统，治疗重型肝炎肝衰竭，显著降低患者的病死率。2019年，李兰娟院士团队在Theranostics上报道，运用蛋白质组学筛选、靶向蛋白组学（PRM）验证的思路开发ACLF临床治疗中诊断及预后血浆蛋白标志物组合（点击查看详细解读），为实现HBV-ACLF预警及预后提供了指导。

近日，李兰娟院士课题组再次在著名临床应用期刊Journal of Clinical Investigation （IF=12.282）上发表了题为Plasminogen as a prognostic biomarker for HBV-related acute-on-chronic liver failure的最新研究成果，报道了一个新型的HBV-ACLF患者预后相关的生物标志物——纤溶酶原。

在亚洲地区，与乙型肝炎病毒有关的ACLF (HBV-ACLF)占总体ACLF病例的70%以上。研究人员通过对10例HBV相关的急性肝功能衰竭(HBV-AHD)患者和20例HBV-ACLF患者进行初步定量蛋白质组学检测，并对候选生物标志物扩大样本量进一步确认，最终发现纤溶酶原（plasminogen，PLG）表达量与HBV-ACLF患者的病程进展情况及生存率密切相关。除此之外，作者提出了一个综合了纤溶酶原水平、肝性脑病发生率、年龄、国际标准化比率(INR)和总胆红素的评价体系(P5值)，并证实了其对HBV-ACLF患者的高级别预测能力和准确性。

图1 研究方案流程图

01.蛋白质组学探寻患者蛋白表达差异

首先作者对10例HBV-AHD 患者以及20例HBV-ACLF患者血清样本（样本策略）进行TMT蛋白定量研究（质谱策略），共鉴定到584个样本中稳定存在的蛋白(图2A)。以1.5倍差异倍数作为卡值，俩类患者中鉴定到136个差异表达蛋白（DEP）(图2B)。生信分析表明，这些DEPs主要与补体活性、蛋白酶抑制剂活性和转运体活性相关，而主要的生物学过程涉及蛋白质代谢、免疫应答和能量通路等。已有研究表明，一些关键的转录因子，如HNF-1α等与HBV-ACLF患者蛋白表达波动密切相关，本研究同样证实了这一点，大量鉴定到的DEPs受到了一些关键上游转录因子的调控（图2D&E）。

图2 蛋白质组学鉴定HBV-AHD /HBV-ACLF患者差异蛋白

02.HBV-ACLF患者预后生物标志物初步判断

与HBV-AHD患者相比，HBV-ACLF幸存者中富集于补体和凝血级联的DEPs被下调，而这些蛋白又在HBV-ACLF死亡患者血清中进一步下调(图3A)。在HBV-AHD与HBV-ACLF患者的136个DEPS中，14个表达量下调，2个表达量上调。主成分分析(PCA)显示这些候选生物标志物可显著分离HBV-AHD患者、HBV-AC LF幸存者和HBV-AC LF死亡患者(图3B)。除此之外，研究者发现利用OPLS-DA分析模型也可根据蛋白表达特色清晰区分HBV-ACLF患者和HBV-AHD患者，以及HBV-ACLF死亡和存活患者(图3C＆D)。

图3 预后生物标志物初筛

03. HBV-ACLF标志物纤溶酶原的发现及验证

通过对候选蛋白的表达量差异比较，并结合模型分析，作者初步判断纤溶酶原可作为HBV-ACLF患者预后生物标志物。扩大样本量进行临床数据跟踪后，研究者进一步发现HBV-ACLF死亡患者组入院时纤溶酶原水平明显低于幸存者组（图4 A&B）。相对低纤溶酶原组，高纤溶酶原组的累积存活率显著提高(图4C)。而入院时纤溶酶原表达量的高低与患者后期器官衰竭数量直接相关，高纤溶酶原患者器官更易维持正常功能(图4F)。此外，伴随脑衰竭/呼吸衰竭等明显临床表现的患者体内纤溶酶原水平低于无症状患者(图4G-K)。

图4 纤溶酶原水平与HBV-ACLF预后及器官衰竭的关系

04. 基于纤溶酶原的预后模型的开发与评价

 

研究者进一步扩大入组人数(分别为207例和148例)再次证实了纤溶酶原作为新的生物标志物的可信度和准确性。除此之外，根据纤溶酶原水平、肝性脑病发生率、年龄、国际标准化比率(INR)和总胆红素制定了预后P5评分(图5A)。P5得分较高的组别(P5>17)患者死亡率明显高于低得分(P5≤17)组(图5B&C)。并且，基于纤溶酶原水平构建的P5评分效果明显优于Child-Pugh、终末期肝病模型(MELD)、慢性肝衰竭联合体 ACLF (CLIF-C ACLF)、中国重型肝炎研究组(COSSH)和 HINT 评分(基于肝性脑病发生率、 INR、中性粒细胞计数和促甲状腺激素的预后评分)等多个评分系统。

图5 P5评分与HBV-ACLF预后的相关性研究

综上所述，本研究利用TMT定量蛋白质组学方法，鉴定到HBV-ACLF和HBV-AHD患者血清中多个差异表达的蛋白，并从中筛选出纤溶酶原作为HBV-ACLF预后标志物。然后通过多次不断扩大样本量，一步步证实其作为生物标志物的准确性和可靠性。最终发现高表达纤溶酶原的患者，从临床表现及最终存活率等方面都明显优于低表达患者。

此外，研究者基于纤溶酶原水平，并结合了肝性脑病发生率、年龄、国际标准化比值(INR)和总胆红素等综合制定了P5评分体系，通过前瞻性队列的进一步验证表明该评分效果明显优于以往的预后模型评分系统。本研究对于进一步改善HBV-ACLF的临床管理和患者预后判断具有重要价值。

参考文献

1，Daxian Wu, et al., 2020, Plasminogen as a prognostic biomarker for HBV-related acute-on-chronic liver failure, J. Clin. Invest.

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