Cell Metab | 张静等揭示乳酸调控肌肉再生的分子机制

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景杰生物 | 报道

肌肉再生高度依赖于组织来源的干细胞的激活和增殖，以及内皮细胞和免疫细胞如巨噬细胞的相互协调。巨噬细胞在调控肌肉组织来源的干细胞-成肌祖细胞 (myogenic progenitor cells) 分化和增殖从而调控肌肉再生过程中发挥重要作用。肌肉再生过程伴随血管新生。内皮细胞是血管重要组成部分，通过血管新生运输氧气和营养物质到周围组织中从而在调控组织平衡过程中发挥重要作用。虽然内皮细胞直接接触高浓度氧气，但是内皮细胞却以糖酵解代谢为主，其中超过80%的ATP产生于葡萄糖催化产生乳酸的过程中。内皮细胞可以进一步增强糖酵解代谢从而为血管新生过程中内皮细胞迁移和增殖提供能量和反应底物。其中PFKFB3（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3）在调控内皮细胞糖酵解过程发挥重要作用【1】。在调控组织平衡过程中，内皮细胞除了依靠血管新生发挥作用外，越来越多的研究表明内皮细胞来源的“血管分泌因子 (angiocrine factors)”在调控组织平衡和促进组织修复过程中也发挥着重要作用【2】。然而内皮细胞来源的代谢产物 (angiocrine metabolites) 能否参与肌肉再生以及如何参与到肌肉再生过程尚未研究。

2020年6月2日，苏黎世联邦理工学院的Katrien De Bock团队（第一作者为张静）在Cell Metabolism杂志上发表文章Endothelial Lactate Controls Muscle Regeneration from Ischemia by Inducing M2-like Macrophage Polarization，揭示了内皮细胞来源的乳酸通过促进单核细胞分化成M2型巨噬细胞来调控肌肉再生。

研究人员利用内皮细胞PFKFB3特异性敲除小鼠 (PDGFB. iCre×PFKFB3^fl/fl)，以下肢缺血模型发现PFKFB3敲除抑制肌肉组织血管新生和肌肉再生。为了研究内皮细胞PFKFB3 调控肌肉组织修复的机制，研究人员首先对下肢缺血后的肌肉组织进行了病理学分析发现内皮细胞PFKFB3敲除小鼠在下肢缺血后低氧反应增强，然而肌肉组织来源的血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 下降，同时肌肉组织对单核细胞募集增强。

因为巨噬细胞也是VEGF非常重要的一个来源，研究人员提取了肌肉组织中巨噬细胞进行RNA-seq 分析，发现M2型巨噬细胞相关标志物表达下降，同时内皮细胞PFKFB3敲除小鼠来源的巨噬细胞糖酵解代谢增强。进一步流式分析发现PFKFB3的敲除减缓单核细胞Ly6C高表达群体到巨噬细胞的转化，并进一步抑制巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。

为了确认M2型巨噬细胞在缺血后肌肉组织修复过程中发挥的功能，研究人员将IL-4诱导骨髓来源巨噬细胞 (BMDMs) 分化成的M2型巨噬细胞注射到小鼠肌肉组织中，发现M2型巨噬细胞显著促进PFKFB3敲除小鼠肌肉组织修复，但并未完全达到对照组水平。说明内皮细胞PFKFB3敲除后对缺血后肌肉组织修复的影响是部分通过对M2型巨噬细胞极化调控发挥作用。

为了解析内皮细胞PFKFB3调控巨噬细胞极化的分子机制，研究人员收集了正常小鼠肌肉组织内皮细胞和PFKFB3敲除内皮细胞来源的培养基并与BMDMs共培养，发现正常肌肉内皮细胞显著促进BMDMs分化成M2型巨噬细胞。

进一步研究发现去除正常内皮细胞培养基中代谢产物后，正常内皮细胞来源的培养基失去诱导BMDMs 分化成M2型巨噬细胞的功能。

通过对正常内皮细胞和PFKFB3敲除内皮细胞来源培养基的细胞因子 (cytokine) 和代谢产物分析发现内皮细胞敲除PFKFB3后，细胞因子无显著变化，而乳酸分泌显著下降。同时在补充生理浓度乳酸后，PFKFB3敲除内皮细胞来源培养基促进M2型巨噬细胞极化能力增强。值得注意的是，仅仅补充生理浓度乳酸而未添加内皮细胞来源的培养基不能促进M2型巨噬细胞极化。

研究人员进一步收集了分化后巨噬细胞培养基，发现PFKFB3敲除内皮诱导的巨噬细胞培养基分泌更多的VEGF。同时将分化后巨噬细胞培养基培养成肌祖细胞，发现PFKFB3敲除内皮诱导的巨噬细胞培养基抑制成肌祖细胞的增殖和分化。通过对小鼠体内移植缓释乳酸的胶体，发现随着乳酸在PFKFB3敲除小鼠内释放可以改善内皮细胞PFKFB3敲除引起的血管新生和肌肉再生减缓。值得注意的是在下肢缺血条件下内皮细胞PFKFB3敲除可以显著降低肌肉组织和血液中乳酸的含量。说明在病理条件下-下肢缺血条件下，内皮细胞也是乳酸的一个重要来源。

单羧酸盐转运蛋白1(MCT1)是乳酸的重要运载体，为了研究内皮细胞来源乳酸促进巨噬细胞极化的分子机制，研究人员用巨噬细胞MCT1特异性敲除小鼠 (LyzM Cre×MCT1^fl/fl) 进行了更深一步的研究。发现在下肢缺血条件下，巨噬细胞MCT1敲除抑制M2型巨噬细胞的分化，同时降低了肌肉组织VEGF的分泌。病理学分析发现MCT1敲除抑制血管新生和肌肉组织再生。放射性标记实验发现巨噬细胞以MCT1作为乳酸运载体将内皮来源乳酸转运到细胞内，并作为底物参与到巨噬细胞氧化代谢。在低氧和营养不足的条件下为巨噬细胞发挥功能提供能量。

总之，这项研究揭示内皮细胞PFKFB3敲除抑制内皮细胞糖酵解代谢，降低了内皮细胞乳酸分泌和小鼠肌肉组织中乳酸含量，从而降低单核细胞分化成促进血管新生和肌肉再生的M2型巨噬细胞的能力。补充乳酸后可以修复PFKFB3敲除内皮细胞M2型巨噬细胞极化的功能。修复的机制是乳酸通过MCT1作为运载体转运到巨噬细胞内，引起巨噬细胞代谢重组。转化成M2型巨噬细胞，促进成肌祖细胞的增殖和分化。同时极化后的M2巨噬细胞分泌更多VEGF，进一步促进内皮细胞的增殖和迁移，从而促进缺血后血管再生和肌肉组织修复。揭示了内皮细胞来源的乳酸 (angiocrine lactate) 在肌肉组织修复过程中发挥着重要作用。

参考文献

1. De Bock, K., et al., 2013, Role of PFKFB3-driven glycolysis in vessel sprouting. Cell.

2. Rafii, S., et al., 2016, Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature.

3. Jing Zhang, et al., 2020, Endothelial Lactate Controls Muscle Regeneration from Ischemia by Inducing M2-like Macrophage Polarization. Cell Metabolism.

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