新晋诺奖得主团队新成果，蛋白组学描绘肠道病毒切割宿主细胞蛋白组全景变化

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景杰学术 | 报道

日前，2020年度诺贝尔生理或医学奖授予了Harvey J. Alter，Michael Houghton和Charles M. Rice，因三位在发现丙型肝炎病毒上的贡献（for the discovery of Hepatitis C virus）。这三位科学家鉴定出一种新型病毒，即丙型肝炎病毒。相关研究发现揭示了其余肝炎病例的病因，并使相关血液检测和新药设计成为可能，挽救了数百万生命。

今天为大家介绍这篇文章，由新晋诺奖得主，洛克菲勒大学病毒学教授Charles M. Rice团队，于2020年9月30日，在病原学国际著名期刊PLOS Pathogens （IF=6.218）上发表。文章题为"Defining the proteolytic landscape during enterovirus infection"。Charles M. Rice教授现任洛克菲勒大学病毒学和传染病实验室的负责人，在病毒学领域发表了近400多篇高水平研究。在该文章中，运用蛋白质组学技术，揭示了5种不同肠道病毒感染后的宿主细胞蛋白酶系统的整体变化与调控机制。

众所周知，病毒在感染过程中会通过切割宿主细胞蛋白质，来重塑宿主蛋白质组，以达到免疫逃逸的目的。然而，关于宿主细胞蛋白酶系统在感染肠道病毒后的整体变化却鲜有报道。为了绘制肠道病毒诱导的蛋白质水解的全景，Charles M. Rice团队首先选择了肠道病毒柯萨奇 B3 型病毒（Coxsackievirus B3, CVB3）感染 HeLa 细胞（因为CVB3已知的蛋白水解靶点可用于验证），用优化后的subtiligase法对未感染和CVB3感染的HeLa细胞在感染后不同时间标记游离N-末端。结合LC-MS分析，对病毒感染后裂解的蛋白进行整体鉴定。

改良的subtiligase标记法识别病毒感染细胞中的蛋白质裂解

结果表明，病毒感染造成大量新N-端的暴露，说明很多宿主蛋白发生切割。感染后6h，21%的N-末端来自P1谷氨酰胺裂解，而在未感染细胞中则为4%，发生在谷氨酰胺-甘氨酸（Q-G）之间的切割也出现了明显的上升。尽管这些裂解可能被宿主蛋白酶催化，但在未感染细胞中，它们的水平普遍较低，这一事实支持了在肠道病毒感染的后期，病毒蛋白酶会诱导细胞凋亡的假说。此外，研究人员还观察到，凋亡途径中的效应蛋白酶caspases也在影响CVB3感染细胞的蛋白水解情况。这些结果表明，改良的subtiligase标记法非常适合于识别病毒感染细胞中的蛋白质裂解。在CVB3感染的细胞中发生了数百次裂解，并且产生的许多肽显示了2Apro、3Cpro和caspase裂解的特征。

CVB3感染对HeLa细胞蛋白裂解的影响

研究人员进一步对所有新裂解蛋白质的数据集进行分析，确定了许多已知的和新的酶解靶点。结果显示，大部分已知的CVB3靶点蛋白，如eIF4G、HNRPD等都被鉴定到，表明N-末端subtiligase标记是一种确定感染相关的切割靶点的可靠方法。研究共找到了173个被切割的宿主蛋白。其中 81个蛋白被切割的位点是病毒蛋白酶的识别序列，涵盖了转录、RNA编辑、细胞骨架、细胞分裂和DNA 修复等多条细胞通路。CVB3蛋白酶的体外试验证实，绝大多数被感染宿主细胞中的蛋白切割都是CVB3 蛋白酶导致的。

CVB3蛋白酶切割靶点的鉴定和验证

研究人员进一步比较了CVB3感染与其他肠道病毒的蛋白水解情况，以确定不同肠道病毒是否存在共同的蛋白水解靶点。研究选择了其他4种肠道病毒：人类鼻病毒A16（HRV）、脊髓灰质炎病毒1（PV）、肠道病毒D70（EV70）和肠道病毒A71（EV71）。蛋白质组学分析分别发现218个（PV）、278个（HRV）、274个（EV70）和206个（EV71）候选宿主靶点。对于大多数蛋白质，在所有被检测病毒的数据集中都检测到相同的肽，表明裂解的特异性。结果表明：肠道病毒主要分裂一组重叠的蛋白质，并且这些分裂在各种细胞类型中是一致的。

多种肠道病毒裂解靶蛋白的鉴定

在被识别出来的宿主目标蛋白中，LSM14A引起了研究者的注意。LSM14A能够被多种肠病毒、在各种细胞类型和成熟神经元中被广泛靶向。该蛋白主要存在于p小体中，参与mRNA转换的细胞质核糖核蛋白颗粒，先前有报道其对某些DNA和RNA病毒的抗病毒免疫有关[2]。研究人员首先通过突变确认了，LSM14A的切割是由2Apro介导的，发生在P1′G位点。功能实验表明LSM14A的表达以剂量依赖性的方式增强了SeV介导的ISRE活性，证实了该蛋白在先天免疫中的作用。敲除RNA 感知蛋白RIG-I 使得LSM14A 活性出现了明显的降低，证明 LSM14A与 RIG-1 共同作用，帮助免疫系统识别入侵病毒。

LSM14A是一种新型的肠道病毒蛋白酶切割灭活的天然免疫应答靶点

综上所述，Charles M. Rice团队通过改良的subtiligase标记法识别病毒感染细胞中的蛋白质裂解，首次报道了宿主细胞在多种肠道病毒感染后的的蛋白酶系统全景变化，研究确定了许多已知的和新的细胞切割靶点，发现了肠道病毒逃脱宿主免疫的全新机制：肠病毒2Apro介导的LSM14A的裂解阻止了它增强抗病毒的防御能力。表明LSM14A是一种新型的肠道病毒蛋白酶切割灭活的天然免疫应答靶点。

该研究为后续研究指明了方向。然而，在这些新发现的病毒蛋白酶的目标蛋白中，是否还有其他病毒感染的关键蛋白？新靶点能否帮助我们开发新的抗病毒药物？诸多未知都值得进一步的挖掘。

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参考文献：

1. Saeed, M., et al., 2020. Defining the proteolytic landscape during enterovirus infection. PLOS Pathogens.

2. Li Y, et al., 2012. LSm14A is a processing body-associated sensor of viral nucleic acids that initiates cellular antiviral response in the early phase of viral infection. Proc Nat Acad Sci USA.

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