Nat Metab | 磷酸化修饰组学揭示雷帕霉素治疗Leigh氏综合征的关键分子作用机制

景杰学术 | 报道

作为细胞内产生能量的“动力工厂”，线粒体通过其呼吸代谢功能保证了细胞内ATP (80% - 90%) 的正常供应。倘若这一代谢过程所必需的蛋白质 (代谢酶、复合物等) 因遗传缺陷发生功能障碍，则会导致细胞能量代谢紊乱，引起多种线粒体疾病的发生。

Leigh氏综合征 (Leigh syndrome, LS) 被认为是在婴幼儿中高发的一类线粒体疾病，由英国神经科学家Denis A. Leigh首次报告。LS病理学特征表现为脑干、基底核等中枢神经系统的灰质区域出现对称性的斑块状坏死性病变，也被称为亚急性坏死性脑脊髓病。目前研究已经发现，线粒体呼吸链复合体I (简称C-I) 中NDUFS4 (NADH Dehydrogenase [Ubiquinone] Fe-S Protein 4) 的功能障碍是导致LS的主要原因之一：Ndufs4 基因敲除后，小鼠会出现典型的LS临床症状，比如大脑中的神经退行性病变、神经炎症等其他进行脑病，并且寿命明显缩短。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，其功能键复合物包括mTORC1和mTORC2，它们介导的信号通路在调控细胞生长、能量代谢等多种细胞功能中都发挥着关键作用，而在许多线粒体疾病中，mTOR活性都处于异常激活状态。已有研究表明，mTORC1抑制剂——雷帕霉素，可以通过重塑细胞新陈代谢功能，明显改善Ndufs4 (-/-) 小鼠的神经系统症状，甚至将Ndufs4 (-/-) 小鼠的寿命延长至少两倍。然而，有关雷帕霉素治疗LS的具体分子机制尚未阐明。

近日，来自美国华盛顿大学基因组学科学研究中心的Judit Villén教授团队，在Nature 子刊Nature Metabolism 上，发表了题为“PKC downregulation upon rapamycin treatment attenuates mitochondrial disease”的研究长文 [1]。他们利用蛋白质组学及磷酸化修饰组学技术（质谱策略），全面分析了敲除Ndufs4 以及雷帕霉素治疗后Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质功能的改变，发现雷帕霉素可以通过下调蛋白激酶C (protein kinase C, PKC) 活性，发挥LS治疗效果。

**一、雷帕霉素影响Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质含量**

利用出生后30天的野生型 (WT)、Ndufs4 (-/-) (KO) 及经雷帕霉素治疗的Ndufs4 (-/-) (KR) 小鼠大脑（样本策略），研究人员共定量检测到6,231种蛋白质，其中1,004种 (16%) 蛋白质的含量在各组间出现显著改变。在KO组中，NDUFS4的缺失导致了大量线粒体蛋白质含量的明显减低，包括大多数C-I蛋白质 (除了ACAD9和NDUFAF2) ；而其他线粒体呼吸链复合体物，比如细胞色素C氧化酶的含量则在整体上有所升高。雷帕霉素治疗 (KR) 除了逆转上述蛋白质含量改变外，还明显降低了mTOR复合物的核心亚基mTOR和mLST8的含量；更为重要的是，常见的三种PKC亚型 (PKC-α, PKC-β and PKC-γ) 的蛋白质含量也在KR组中明显减低，暗示雷帕霉素可能抑制PKC活性。

图1 NDUFS4缺失对小鼠大脑蛋白质含量的影响

**二、雷帕霉素抑制Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑PKC活性**

考虑到mTOR的激酶本质，研究人员推测雷帕霉素对mTOR含量的改变会影响Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质的磷酸化修饰水平。利用磷酸化修饰组学（质谱策略），作者们定量检测到了15,971个磷酸化修饰位点，约26%的位点是首次报道。在KO组中，NDUFS4的缺失只引起了少数激酶含量的变化，所以整体上并没有明显改变蛋白质磷酸化修饰水平。与此不同的是，雷帕霉素治疗 (KR) 则使得Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质的磷酸化修饰水平出现了显著改变，其中，多种mTOR复合物亚基、mTOR信号作用底物以及PKC的磷酸化水平都出现了明显下调。随后，通过激酶-底物富集分析 (kinase–substrate enrichment analysis, KSEA)，研究人员发现KR组中的PKC-β活性显著降低。不仅如此， KR组中，许多参与细胞内Ca²⁺稳态调节的蛋白质功能都受到了抑制，如ITPR1 基因编码的内质网Ca²⁺释放通道1,4,5-三磷酸肌醇受体的蛋白质含量及磷酸化修饰水平都显著降低。由于PKC亚型 (PKC-α, PKC-β and PKC-γ) 的激活多依赖Ca²⁺，以上这些证据共同表明，雷帕霉素治疗后的Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑中，PKC活性受到了抑制。

图2 雷帕霉素对Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑PKC活性的抑制作用

**三、雷帕霉素通过抑制PKC活性缓解Ndufs4 (-/-) 小鼠LS症状**

倘若雷帕霉素是通过下调PKC活性以治疗线粒体疾病，那么理论上，PKC特异性抑制剂也可以起到相似的治疗效果。已有研究表明，Ndufs4 (-/-) 小鼠由于异常激活的皮肤炎症反应会引起大量毛发脱落，这种现象在一定程度上能够被雷帕霉素所缓解。值得注意的是，研究人员发现广谱PKC抑制剂 (GO6983 和GF109203X) 以及PKC-β特异性抑制剂ruboxistaurin都比雷帕霉素更好地改善了Ndufs4 (-/-) 小鼠的毛发脱落现象。不仅如此，三种PKC抑制剂都明显了延长了Ndufs4 (-/-) 小鼠寿命、延缓了神经功能障碍发病时间，同时，ruboxistaurin对Ndufs4 (-/-) 小鼠神经炎症反应的治疗效果也最为明显。

图3 PKC抑制剂对Ndufs4 (-/-) 小鼠的治疗作用

本文中，蛋白质组学、磷酸化修饰组学数据在帮助研究人员系统了解Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质功能改变的基础上，也为阐明雷帕霉素治疗线粒体疾病的分子机制提供了有说服力的证据支持。更为重要的是，雷帕霉素药物靶点PKC的发现，或将为Leigh综合征等罕见线粒体疾病的明确诊断、精准治疗提供崭新思路。

磷酸化修饰组学

磷酸化修饰（phosphorylation）发生在细胞内超过30%的蛋白质上，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制。磷酸化参与各种生理和病理过程，调控细胞的增殖、发育、分化、凋亡等生命活动，广泛运用在信号通路转导、细胞凋亡、发育分化、癌症机理等研究领域。

景杰生物率先推出高深度磷酸化修饰定量分析，使用专有抗体靶向富集磷酸化修饰肽段，降低样本复杂性；结合严格的双重质控和生信分析，强强联合，广泛应用在生理病理下磷酸化机制研究。

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