Circ Res | 流感"后遗症"：在康复期导致心脏蛋白质组和磷酸化修饰组重塑，激活细胞坏死

景杰学术 | 报道

心脏病、癌症和呼吸道感染是全球三大死亡原因。呼吸道感染通常是由流感病毒引起的，美国每年约有3.6万多人因流感感染死亡，其中导致高死亡率的一个关键因素是在流感恢复期间发生的不良心脏事件 (MACE)。大量研究证明，特别是在严重感染期间，流感病毒会从肺部传播到心脏组织，从而导致心肌炎、缺血和心功能不全。然而，流感病毒性肺部感染与心脏生物学改变之间的潜在分子联系仍不清楚。

细胞发生程序性死亡的能力对促进宿主恢复具有重要作用。坏死 (necroptosis) 是细胞在强烈的理化或生物因素作用下导致的细胞无序性死亡过程，在病毒感染过程中对宿主的存活起促进作用，但会引起局部严重的炎症反应，受到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 RIPK1，RIPK3，以及坏死效应分子MLKL调控。在甲型流感病毒 (IAV) 感染期间，病毒会利用自我编码的蛋白质来阻止细胞凋亡，而宿主细胞即会试图通过表达RIPK3启动坏死或重启细胞凋亡程序来阻止病毒复制。抑制坏死效应分子MLKL可能会促进细胞凋亡活性，进而增强宿主的抗病毒能力。然而到目前为主，坏死还没有与流感感染的心脏应答有关联。

2021年1月27日，来自美国罗克韦尔的研究人员于Circulation Research (IF=14.467) 上发表题为“Influenza Causes MLKL-Driven Cardiac Proteome Remodeling During Convalescence”的最新研究论文，通过label-free定量蛋白质组和磷酸化修饰组学，首次证实了IAV肺流感感染清除后心脏蛋白组和磷酸化修饰组的全景差异性变化，并提出坏死抑制剂可作为流感感染期间减少心脏损伤的潜在干预措施。

一、流感病毒感染可引起心肌细胞凋亡、氧化应激和细胞代谢紊乱，但不激活病毒复制

研究首先用大流行毒株A/California/7/2009 (IAV) 侵染大鼠H9c2心肌细胞和人AC16心肌细胞（样本策略），发现细胞在感染后48h细胞毒性增加，但病毒复制未被激活，这表明心肌细胞通过细胞凋亡抑制了病毒复制。而48小时后，磷酸化MLKL增加，线粒体ROS介导的氧化损伤升高，ATP生成减少。如果用坏死抑制剂 (ponatinib, pazopanib 或 necrosulfonamide）对心肌细胞预处理后再进行病毒侵染，则细胞毒性显著降低，ROS产生明显减少（图1）。证明流感感染可激活坏死，并促进线粒体依赖的氧化应激，而抑制了坏死作用可以部分挽救IAV诱导的心肌细胞凋亡。

图1 流感病毒感染导致心肌细胞坏死、氧化应激和代谢分解

二、抑制MLKL可提高抗氧化作用和线粒体活性

IAV病毒是否能转运到心脏，或者是否在从肺清除出去后，持续存在于心脏组织中呢？实验发现，IAV感染后心脏结构发生了显著变化，且在心脏组织中发现了IAV病毒颗粒。值得注意的是，IAV在侵染时期通过促进炎症相关因子TNF和IFN，促进了细胞坏死，而MLKL抑制剂作用下可以保护心肌细胞（图2A-C）。此外还发现了Caspase-3活性明显增加，提示抑制坏死促进了细胞凋亡。

研究随后对未感染或感染IAV后恢复的，WT (C57BL/6) 和MLKL缺陷小鼠 (MLKL KO) 的心脏蛋白组（样本策略）进行了基于质谱的label-free蛋白组定量技术 (LFQ) 分析（质谱策略），从1,592种定量蛋白质中筛选出295种差异蛋白质（图2D）。数据表明，在IAV感染的心脏中，蛋白质丰度较低，表明在IAV感染期间心脏组织中的能量产生大大降低（图1I）；热休克蛋白90 (Hsp90) 下调，表明心脏蛋白稳态改变；还发现谷胱甘肽代谢和抗氧化代谢途径上调（图2D），表明心脏组织试图减轻由流感感染引起的氧化应激。

图2 流感病毒在恢复期持续存在于心脏，并导致蛋白组重塑

三、感染IAV的MLKL缺陷小鼠的心脏蛋白质组和磷酸化修饰组在恢复期被重塑

接下来，研究探索了当坏死被阻断后，IAV感染引起的心脏组织应答，即比较了IAV感染的WT小鼠 (WT+IAV) 和MLKL KO小鼠 (KO+IAV) 的心脏蛋白组（样本策略），从1,029种定量蛋白质中发现220种显著变化 (KO+IAV心脏中158种上调，62种下调)。在KO+IAV心脏样本中，上调最显著的蛋白质是NAD(P)转氢酶 (Nnt)，其能维持线粒体NADPH水平和介导氧化应激防御。调节蛋白酶体分解过程和调节吞噬过程的成分也被富集（图3A-B），提示阻断坏死可能重新激活心脏中的替代途径以对抗IAV。

AKT、CaMKII和AMPK⍺的磷酸化修饰在调节细胞生长、凋亡、心功能和发育中起重要作用，其在WT+IAV和KO+IAV心脏中减少（图3C-D）。之后，使用基于TiO2的磷肽富集进行了磷酸化修饰蛋白组分析（质谱策略），共识别了来自四组心脏样本的898种磷蛋白中的2,340种独特的磷酸化肽，其中591种独特的磷蛋白（只在磷酸化组中被鉴定到，蛋白组中并没有）中大多数与mRNA加工和剪接有关，其他307种共有蛋白与心肌收缩和肌原纤维组装过程密切相关。

图3 流感病毒导致MLKL缺陷小鼠心脏蛋白质组重塑

磷酸化蛋白组数据中1,691个磷酸化肽在4组中表示出显著不同，其中97%在IAV感染的心脏中下降，这表明IAV感染期间一般的蛋白质去磷酸化可能会对心功能产生影响。其中包括Akt，AMPK，PKA，PKC β和δ，以及凋亡相关蛋白，提示细胞间通讯和细胞增殖可能失调。几种线粒体蛋白在感染过程中表现出不同的磷酸化趋势：上调的磷蛋白包括Ant1和Pdha1，下调的磷蛋白包括Vdac1、Bckdha和Uqcrc1（图3A-B）。除此以外，心肌细胞可能不是唯一受IAV感染影响的细胞，内皮细胞和心脏成纤细胞也可能受到感染。

为了更好地了解坏死如何影响IAV感染后心脏组织的磷酸化修饰，将KO+IAV组与WT+IAV组进行了配对比较（样本策略），发现分别显著上/下调的72，76个磷酸肽（图3B）。上调的磷蛋白包括心脏调节蛋白HDAC1和HDAC12，下调的磷蛋白包括凋亡相关蛋白如Bcl家族蛋白、PML蛋白和Cryab，以及介导心肌细胞中CA2+稳态的膜蛋白如SERCA，Pln，Ryr2。此外，MPTP能维持Ca2+稳态并介导坏死细胞凋亡，NAD的缺失会导致线粒体损伤和坏死，所以通过实验，研究证明了使用抗氧化剂或抑制坏死（抑制MPTP或补充NAD）可以显著降低细胞毒性和氧化应激，增加ATP，保护心肌细胞免受流感介导的损伤（图4C-F）。

图4 流感病毒导致心脏磷酸化修饰组改变，抑制MPTP和补充NAD可保护心肌细胞

小结

本篇研究以感染后恢复/未感染IAV的野生型和坏死缺陷 (MLKL-KO) 小鼠心脏为样本，利用基于质谱的label-free定量蛋白质组和磷酸化修饰组学等技术手段进行了系统分析，首次证实了肺流感感染后心脏蛋白质组和磷酸化修饰组全景会发生显著改变，而病毒粒子可以继续作用于心脏，改变线粒体功能，促进细胞死亡。重要的是，研究表明当坏死作用被抑制时，IAV感染后的氧化应激和线粒体损伤被减轻了，表现出对IAV病毒的一定抵抗作用，可作为减少流感感染期间心脏损伤的潜在治疗干预措施。

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