GPB：河南农大陈锋课题组首次绘制小麦二羟基异丁酰化修饰图谱

赖氨酸酰化修饰家族包含了乙酰化、丙酰化、琥珀酰化、二羟基异丁酰化等在内的10余种修饰种类。该家族的不同成员在多种重要生物学过程中的参与作用也成为了近些年的生物学领域研究热点之一。赖氨酸二羟基异丁酰化修饰（Khib）于2014年被首次鉴定。自发现以来，Khib已被证明广泛发生于组蛋白并对精子细胞的分化起到重要的调控作用、在酵母糖平衡过程中的重要作用等。除此之外，能够调控Khib修饰基团添加或去除的酶也被不断鉴定出来，如EP300、Tip60、CobB等，其调控酶系统的深入研究又为了解该修饰的具体生物学功能提供了助力。

然而截至目前，关于Khib的报道仍主要集中在哺乳动物细胞、酵母、模式细菌等层面，在植物领域知之甚少。普通小麦，由于其六倍体基因组的复杂性和独特性，相对于其他植物（如拟南芥、烟草等）更难进行新技术的应用以及新领域的探索。目前只有赖氨酸琥珀酰化和丙二酰化两种新型酰化修饰在小麦中存在报道，而Khib这种新型的且在代谢层面发挥关键作用的修饰是否在小麦中存在重要参与性，至今为止仍未可知。

2021年2月10日，河南农业大学陈锋教授课题组在著名学术期刊Genomics, Proteomics & Bioinformatics 发表论文，首次在普通小麦中进行了二羟基异丁酰化修饰图谱绘制。作者共鉴定到1,074个蛋白上面的3,348个修饰位点。这些蛋白广泛参与到小麦体内一些关键生物学或代谢过程，并且有大量发生二羟基异丁酰化修饰的蛋白同时发生了其他修饰。利用点突变和Co-IP等实验，作者证实糖酵解的关键酶磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase，PGK）的K206号位点二羟基异丁酰化修饰显著影响其酶活性。除此之外，二羟基异丁酰化修饰也影响了PGK与其他底物互作的能力。本文还发现一些低分子量蛋白的修饰水平受去乙酰化酶抑制剂调节。景杰生物为该研究提供二羟基异丁酰化修饰组学技术服务及抗体支持。

作者首先通过基于泛抗体的Western实验发现不同品种小麦中Khib均普遍存在，且主要集中于40-70kDa分子量蛋白。通过高通量质谱检测，研究共鉴定到小麦中1,074个蛋白上面的3,348个Khib修饰位点，其中超过50%的蛋白含有多个Khib修饰位点。本研究鉴定到的Khib修饰蛋白总数量超过之前在植物中所报道的乙酰化、丙二酰化等修饰，这再一次证实了Khib在植物中的普遍性及重要性。

图1  小麦中二羟基异丁酰化修饰图谱绘制

为进一步探索小麦中Khib蛋白的作用发挥场所和途径，作者进行了一系列的生物信息学分析。亚细胞定位结果显示，Khib蛋白大多分布在小麦叶绿体和细胞质中。而KEGG分析展示出这些发生修饰的蛋白广泛参与到多种关键生物学过程中，比如包括碳代谢、碳固定等在内的初级代谢过程。定位到叶绿体的蛋白中，有37个参与到光合作用，其中包含Rubisco等重要且植物体内高丰度表达的关键酶。

图2  对Khib蛋白的分子特征分析

为探究Khib在其他物种中的保守及普遍性，BLAST显示共有178个Khib蛋白存在于小麦、水稻和小立碗藓中；752个小麦中鉴定到的修饰蛋白，分别有460和114个在小立碗藓和水稻中保守存在；332个在小麦中特异性出现的Khib蛋白主要参与到光合作用和碳代谢途径中。除此之外，作者将已发表的小麦其他酰化修饰结果与本研究进行对比，分析发现有大量蛋白可以发生乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化和二羟基异丁酰化多种修饰。

图3  Khib在不同物种间的保守性以及与其他修饰之间的关系

组学结果鉴定到多个关键代谢酶发生Khib修饰，其中包含PGK。共有三个PGK发生修饰，其中W5H4V7含有7个Khib修饰位点。为进一步探讨修饰发生对其功能的影响，作者对PGK进化保守的K206位点进行点突变（K206Q/K206R）。酶活实验显示K206Q（模拟其修饰状态）显著提高了PGK的酶活性，反之K206R使其降低。基于质谱的互作蛋白鉴定实验发现，三种不同状态的K206位点（WT/ K206Q/K206R）对PGK互作蛋白的数量和种类产生明显影响，证实了修饰调节其蛋白互作能力。

图4  PGK二羟基异丁酰化修饰影响其酶活性及蛋白互作能力

最后，为了研究小麦内发生的二羟基异丁酰化修饰是否受到组蛋白去乙酰化酶HDAC调节，作者对小麦喷施HDAC抑制剂，并证明小麦内Khib水平受到显著影响。

本文通过基于抗体的修饰蛋白富集以及质谱检测，鉴定到普通小麦中1,074个蛋白上面的3,348个修饰位点，并发现了二羟基异丁酰化修饰在植物中的物种保守型。这些小麦中修饰蛋白参与到光合作用、糖酵解、蛋白代谢等诸多的关键生物学过程中。大量发生二羟基异丁酰化修饰的蛋白可同时发生了其他修饰，证明了修饰间crosstalk的普遍可能性。利用点突变和Co-IP等实验，作者证实糖酵解的关键酶磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase，PGK）的K206号位点二羟基异丁酰化修饰显著影响其酶活性。除此之外，二羟基异丁酰化修饰也影响了PGK与其他蛋白互作的能力。本文还发现一些低分子量蛋白的二羟基异丁酰化修饰水平受去乙酰化酶HDAC调节，HDAC抑制剂的处理对小麦体内二羟基异丁酰化修饰水平影响明显。

景杰生物为该研究提供二羟基异丁酰化修饰组学技术服务及特异性泛抗体支持，感谢河南农业大学陈锋教授课题组的信任和支持！

二羟基异丁酰化（2-Hydroxyisobutyrylation, khib）是一种较高丰度的赖氨酸蛋白翻译后修饰类型，在原核生物和真核生物中广泛存在。Khib广泛发生于组蛋白上，并对生殖细胞的分化起到重要的调控作用。此外，Khib与糖代谢、氨基酸合成、糖酵解等生物学过程密切相关，Khib修饰及其调控逐渐成为表观遗传、代谢调控领域的研究热点。

Khib调控酶

修饰酶：TIP60、P300

去修饰酶：HDAC2、HDAC3、Rpd3p和Hos3p

※ 案例：2-羟基异丁酰化修饰（Khib）：Writers、Erasers和修饰底物的发现

Landscape of the regulatory elements for lysine 2-hydroxyisobutyrylation pathway. 2017. Cell Research (IF=20.507).

※ 案例：P300作为二羟基异丁酰转移酶调控糖酵解途径

P300-Mediated Lysine 2-Hydroxyisobutyrylation Regulates Glycolysis. 2018. Mol Cell (IF=15.584).

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参考文献：

Ning Zhang, et al., 2021. Global Profiling of 2-hydroxyisobutyrylome in Common Wheat. Genomics, Proteomics & Bioinformatics.

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