邹文安
多能性 (pluripotency) 指的是细胞生成所有组织细胞类型的能力，是早期胚胎发育的一个暂时特征。多能干细胞 (pluripotent stem cells, PSCs) 就是一类具有自我更新、自我复制能力的多能性细胞，在体外不同培养条件的特定刺激下，可以进行扩增并多向分化产生一系列具有不同特性的细胞状态。深入研究PSCs多能性调控机制，在推动完整、准确、全面理解胚胎发育过程的同时，也将有助于揭示细胞命运变化如体细胞重编程和转分化、癌症、衰老等不同生理、疾病状态下的转变机制。
小鼠PSCs是研究细胞多能性调控机制的经典模型，常见具有三个完全不同的多能状态：基态 (ground state; 2i ESCs)、亚稳态 (metastable state; S/L ESCs)、待激活态 (primed state; EpiSCs)。重要的是，PSCs在不同状态下，基因组、转录组和代谢组方面都具有显著差异。举例来说，基态和亚稳态ESCs依赖氧化磷酸化和糖酵解功能以产生能量，而EpiSCs的能量来源则主要是糖酵解途径；不仅如此，代谢方式的改变又能通过影响蛋白质翻译后修饰 (post-translational modifications, PTMs)，调节多种细胞功能。然而，目前针对PSCs不同多能状态下的PTMs的动态变化研究还比较少。
赖氨酸巴豆酰化修饰 (lysine crotonylation, Kcr) 是2011年芝加哥大学赵英明教授团队在国际顶级Cell杂志首次报道的新型酰化修饰之一 [1]。如今，大量研究已证明，Kcr广泛分布于哺乳动物、植物、微生物等多种物种的组蛋白和非组蛋白中（点击查看文章详情），伴随着Kcr关键调控蛋白质 (P300/CBP、PCAF、AF9 YEATS结构域、CDYL、ECHS1) 的不断发现，Kcr也被证明是一种多功能的PTM，精细调控着精子形成、急性肾损伤、心肌肥厚、抑郁等诸多生理病理进程。
2021年3月19日，中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员鲍习琛、Miguel A. Esteban(共同通讯作者) 等研究人员，在Genomics, Proteomics & Bioinformatics上发表题为 “Global Profiling of the Lysine Crotonylome in Different Pluripotent States”的研究文章 [2]，他们利用景杰生物独有的巴豆酰化修饰组学技术，鉴定到了小鼠PSCs中最高深度的巴豆酰化修饰位点数量 (8,102个)，首次系统性地分析了巴豆酰化蛋白质在小鼠PSCs在不同分化状态下的动态变化，为深入揭示PSCs多能性维持的调控机制提供了全新的科学线索。景杰生物研究人员为本文的共同第一作者、共同通讯作者。
一、PSCs不同分化状态下巴豆酰化修饰蛋白质的鉴定
首先利用巴豆酰化修饰组学技术，研究人员系统性地分析了小鼠PSCs 不同分化状态下：2i ESCs, S/L ESCs, EpiSCs, 以及S/L ESCs诱导的早期分化阶段细胞 (Diff)，巴豆酰化蛋白质的分布情况。他们一共鉴定到2,578个巴豆酰化蛋白质和8,102 Kcr位点，其中就包括去巴豆酰化修饰酶HDAC1，并且，生物学重复样本的组学数据具有很好的一致性，主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA) 也可以明显区分4种分化状态的PSCs，体现了此次研究数据的优质性。
图1 小鼠PSCs细胞巴豆酰化蛋白质的鉴定
二、深度解析PSCs巴豆酰化蛋白质
研究人员进一步详细分析了1,426个高置信度巴豆酰化蛋白质，其中，686个蛋白质有至少2个Kcr位点，30个蛋白质的Kcr位点数超过12个；亚细胞定位预测分析显示，巴豆酰化蛋白质广泛分布于细胞核、细胞浆、细胞膜、细胞骨架以及线粒体等细胞器中；巴豆酰化蛋白质功能与多能性功能调控密切相关，如RNA生物发生、核糖体功能 (GO)，并富集于碳代谢、蛋白酶体通路 (KEGG)，并且在诸多参与多能性维持与分化的蛋白质上也鉴定到了Kcr。重要的是，与已发表的其他细胞系 (H1299, Hela, A549, HCT116等) 巴豆酰化修饰组学相比较，此次研究数据不仅鉴定到的巴豆酰化蛋白质数量最多，还发现了886个PSCs特有的巴豆酰化蛋白质，突显了巴豆酰化修饰组学鉴定深度对研究的重要性。随后，利用巴豆酰化修饰泛抗体，研究人员对其中16个蛋白质的巴豆酰化修饰做了进一步验证。
图2 PSCs中巴豆酰化蛋白质的功能分析
三、PSCs在不同分化状态下巴豆酰化修饰的动态变化
三、PSCs在不同分化状态下巴豆酰化修饰的动态变化
作为此次研究的重要组成部分，研究人员接下来重点研究了不同分化状态下PSCs中蛋白质 (非组蛋白) 巴豆酰化修饰水平的动态变化，通过表达模式聚类分析得到了5种不同的巴豆酰化修饰变化趋势 (cluster Ⅰ-Ⅴ)。值得注意的是，那些参与TCA循环、糖酵解途径、磷酸戊糖途径的巴豆酰化蛋白质则在PSCs分化过程呈高度动态变化趋势，其中，EpiSCs中糖酵解途径关键酶的巴豆酰化修饰水平明显增强，而2i ESCs中，TCA循环和磷酸戊糖途径相关酶的巴豆酰化修饰水平则相对较强，证明了蛋白质巴豆酰化修饰水平改变可能是影响PSCs代谢方式的主要原因，再次强调了蛋白质翻译后修饰在代谢功能调控中的重要角色。
图3 PSCs分化状态对蛋白质巴豆酰化修饰水平的影响
四、巴豆酰化修饰调控多能性基因表达
为了探究蛋巴豆酰化修饰对多能性的调控作用，研究人员进一步利用巴豆酸 (crotonic acid) 处理S/L ESCs细胞，这导致了多能性基因Nanog、Dppa2表达水平的明显上调，并伴随分化基因Fgf5、Pax6的下调，提示蛋白质巴豆酰化修饰增强有利于细胞维持多能性。不仅如此，巴豆酸还促进了蛋白酶体活性，这很有可能是由于增强了蛋白酶体亚基 (PSMD11和PSMD14) 的巴豆酰化修饰水平所致，因此，研究人员推测巴豆酰化修饰水平可以通过改变蛋白酶体活性调控PSCs多能性。
图4 巴豆酸对PSCs巴豆酰化修饰及多能性的影响
多能干细胞的分化特性早已令其在发育研究、药物筛选、细胞治疗、疾病模拟等领域内备受瞩目，多维度深入理解干细胞分化调控机制因此也成为了科学界持续关注的焦点问题。本次研究中，高深度的蛋白质修饰组学技术不仅帮助研究人员鉴定到了最全面的蛋白质巴豆酰化修饰信息，并且结合小鼠PSCs分化状态的动态变化，也为蛋白质巴豆酰化修饰调控细胞多能性的机制提供了诸多科学解释，这为未来深入挖掘蛋白质巴豆酰化调控细胞分化的具体分子机制奠定了坚实的理论基础。
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参考文献：
1. Minjia Tan, et al. 2011. Identification of 67 Histone Marks and Histone Lysine Crotonylation as a New Type of Histone Modification.Cell.
2. Zhongyu Xie et al. 2021. Global Profiling of the Lysine Crotonylome in Different Pluripotent States. Genomics, Proteomics & Bioinformatics.