Nature背靠背｜乳酸，肿瘤“贿赂”Treg的“代谢货币”

景杰学术 | 解读

T淋巴细胞，由于其在胸腺 (thymus) 内分化成熟，故又称为T细胞，混合了一群功能不同的异质性淋巴细胞，在适应性免疫应答过程中发挥着关键作用。在表面T细胞抗原受体 (T cell receptor, TCR) 活化后，初始T细胞 (naive T cells) 逐渐“驱动分化”成具有多种生物学功能的效应T细胞 (effector T cell)，并产生少量记忆T细胞 (memory T cell) ，它们通过分泌细胞因子、物理接触等方式发挥免疫调控作用。其中，根据效应T细胞表面标志物的不同，又可将其分为调节T (regulatory T cell, Treg)、细胞毒T (cytotoxic T cell)、辅助T (helper T cell) 等亚群。

Treg是一类具有免疫无能和免疫抑制特性的T细胞，在人和小鼠外周血及淋巴细胞中约占5%~10%，它们对维持机体免疫耐受、控制免疫排斥反应、预防自身免疫性疾病至关重要。此外，肿瘤微环境 (tumor microenvironment, TME) 中存在的大量Treg，如今也被认为是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的“罪魁祸首”，它不仅能通过细胞间的直接接触抑制免疫效应细胞 (T细胞、NK细胞、树突状细胞) 的功能，还能通过分泌可溶性细胞因子 (如IL-10、TGF-β)、颗粒酶、穿孔素等多种方式发挥免疫抑制作用。清除TME中聚集的Treg、抑制Treg的分化和扩增也被认为是肿瘤免疫治疗中极具前途的发展方向。因此，深入理解Treg功能调控机制成为了新时代成功开发肿瘤免疫治疗药物的重要前提。

2021年2月15日， Nature杂志“背靠背”在线发表的两篇有关Treg的最新研究，不约而同地将Treg活性调控的核心锁定于糖酵解途径。其中，美国匹兹堡大学Greg M. Delgoffe教授团队研究文章标题为 “Metabolic support of tumour-infiltrating regulatory T cells by lactic acid ”【1】，证明肿瘤细胞不仅能通过营造一个代谢物缺乏的微环境以剥夺效应T细胞的营养，逃避“追杀”，还为Treg提供乳酸，团结“盟友”，共同对抗效应T细胞；极为类似地，在另一研究中，纪念斯隆-凯特琳癌症中心Taha Merghoub教授团队的研究则以 “CTLA-4 blockade drives loss of Treg stability in glycolysis-low tumours”【2】为题，阐明了阻断Treg免疫检查点CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)去稳定Treg的效应依赖于肿瘤细胞及Treg的糖酵解活性，低糖酵解性细胞对于抗CTLA-4免疫治疗更为敏感，为CTLA-4免疫疗法与糖酵解抑制剂联合应用治疗肿瘤的策略提供了理论支持。

更为重要的是，2019年芝加哥大学赵英明教授团队首次突破性地在Nature报道，糖酵解产物乳酸是重要的表观遗传调控分子，它可以通过组蛋白乳酸化修饰 (lactylation) 作用基因表达【3】。这些结果令我们有理由大胆猜测，蛋白质乳酸化修饰也极有可能参与到Treg等免疫细胞的功能调控过程。

一

乳酸对Treg细胞的代谢支持作用

1. Treg细胞与传统T细胞在正常和移植肿瘤组织中具有截然不同的代谢特征

作者通过对Foxp3报告小鼠肿瘤内分离的Treg细胞免疫抑制能力进行监测，发现其抑制能力与肿瘤细胞的高度糖酵解水平呈现相关性。然而，肿瘤微环境中存在的Treg细胞代谢功能并没有受到抑制，反而增殖活跃。后续作者通过对细胞进行线粒体OXPHOS的抑制剂oligomycin处理、荧光葡萄糖示踪剂2NBDG监测等方法，发现与传统T细胞相比，Treg细胞对葡萄糖摄取明显变少，可能以不依赖于葡萄糖的代谢方式支持其增殖存活。

图1. Treg细胞与传统T细胞在正常和移植肿瘤组织中具有截然不同的代谢特征

2. 嗜糖与Treg细胞“低能”的相关性

作者分别纯化出葡萄糖亲和能力低 (2NBDG^low) 和高嗜糖 (2NBDG^high) 的Treg细胞亚群来观测其功能。研究发现，2NBDG^highTreg细胞的抑制能力相对于2NBDG^low降低，且最终导致细胞不稳定性增强。通过分析两者转录组后发现，2NBDG^highTreg细胞中Foxp3等Treg细胞特色基因表达量显著降低。与此同时，2NBDG^low亚群表现出更高的糖酵解终端步骤酶类的表达，包括乳酸脱氢酶和MCT1。

图2. 嗜糖可导致Treg细胞能力下降

3. Treg细胞可代谢乳酸支持自身增殖和抑制功能

作者先在Foxp3^YFP-cre报告小鼠获取的淋巴细胞内装载pH指示剂染料，然后与乳酸共同培养，可以明显观察到Treg细胞对乳酸的摄取，且这种摄取能力在不同组织来源的Treg细胞中表现出异质性。为了研究Treg细胞如何利用乳酸，作者利用13C标记乳酸进行跟踪观测，发现Treg细胞将乳酸转化为丙酮酸，继而转化为苹果酸和柠檬酸，表明其最终被导入线粒体并参与三羧酸循环。除此之外，研究显示Treg细胞还可将乳酸衍生的碳提供给PEP（由PEPCK催化形成），而PEP可提供上游糖酵解中间产物来促进细胞增殖。PEPCK抑制剂3MP的处理，可显著降低Treg细胞增殖能力，但不影响其抑制功能。

图3. Treg细胞可代谢乳酸支持自身增殖和抑制功能

4. 肿瘤微环境中Treg细胞的乳酸摄取对其功能发挥至关重要

作者首先对Treg特异性的MCT1缺失小鼠进行观测，发现尽管缺少了乳酸摄取，但Treg细胞的生存和功能没有受到明显影响。但对MCT1缺失小鼠接种B16黑色素瘤，会导致肿瘤生长减慢，小鼠生存周期变长，预示着Treg细胞在肿瘤组织中的免疫抑制功能发挥可能与其乳酸的摄取能力密切相关。更加重要的是，作者将MCT1药物抑制与PD-1免疫治疗结合，发现一旦阻止肿瘤微环境中Treg细胞摄取乳酸会明显提高免疫治疗的效果，抑制肿瘤生长。

图4. 阻碍肿瘤微环境中的Treg细胞摄取乳酸会减缓肿瘤生长并增加对免疫治疗的反应

二

低糖酵解性肿瘤中，阻断CTLA-4有效地使Treg失活

1. 肿瘤糖酵解活性抑制免疫治疗效果

研究人员首先发现外源性乳酸或是小鼠乳腺癌细胞系4T1 (高糖酵解活性) 存在的情况下，T细胞活性明显降低，暗示了肿瘤糖酵解活性/乳酸对T细胞功能的负面影响。此外，结合RNA测序数据发现，人黑色素瘤在CTLA-4单克隆抗体Ipilimumab治疗前，葡萄糖代谢基因表达水平大多与免疫细胞浸润情况呈负相关，Ipilimumab则在一定程度逆转了上述关联。但值得注意的是，Ipilimumab并没有改变许多糖酵解代谢关键基因 (如LDHA和MCT1) 与免疫细胞浸润的负相关性，这侧面提示了，在高糖酵解活性肿瘤中，单纯通过阻断CTLA-4无法有效地发挥免疫治疗效果。为了对此现象进一步验证，研究人员随后在4T1中knock down LDHA(4T1-KD)，这在降低4T1细胞糖酵解活性及乳酸生成能力的同时，也轻微地减慢了肿瘤细胞在免疫活性小鼠中的生长速度，并且LDHA表达水平与免疫细胞浸润的关联性也由负变正，这种正相关性在抗CTLA-4治疗后变得越为明显。

图5. 抗CTLA-4对糖酵解基因与免疫细胞浸润相关性的影响

2. 低糖酵解性肿瘤对抗CTLA-4免疫治疗更敏感

将4T1-KD和4TI-Sc细胞移植入小鼠体内后，围手术期抗CTLA-4治疗可以显著延长术后4T1-KD移植小鼠的存活时间，有意思的是，4T1-KD移植小鼠在经过抗CTLA-4治疗、手术切除肿瘤100天后，再次植入4T1-KD和4TI-Sc细胞，两种细胞增殖速率都明显被延缓，这些结果揭示了抑制肿瘤糖酵解活性对提高抗CTLA-4免疫治疗疗效的重要性。

图6. 肿瘤糖酵解活性对抗CTLA-4免疫治疗疗效的影响

3. 葡萄糖、CD28对Treg功能的影响

在体外，与对照组4T1-Sc细胞相比，4T1-KD对葡萄糖的利用率明显降低，并且Treg与4T1-KD共培养后，免疫相关因子IFN-γ、TNF-α产量也显著升高。更为重要的是，在葡萄糖存在、CD28共激活的情况下，抗CTLA-4增加了Treg葡萄糖摄取量及IFN-γ分泌并提高了CD86的表达量，提示抗CTLA-4抑制Treg功能从而解除了Treg介导的免疫抑制作用；但是，抗CTLA-4却不影响缺失CD28的Treg细胞功能，而激活CD28则能完全逆转抗CTLA-4的效应，这些结果共同提示葡萄糖、CD28在介导Treg功能的重要作用。

图7. 肿瘤糖酵解活性对抗CTLA-4免疫治疗疗效的影响

总的来说，以上两篇研究共同表明，糖酵解活性、乳酸是调节Treg细胞功能的关键因素，一方面，高糖酵解性肿瘤分泌的大量乳酸可以通过维持Treg细胞的免疫抑制功能，抑制效应T细胞的功能，实现肿瘤免疫逃避；另一方面，降低肿瘤糖酵解活性则能有效地抑制Treg功能，并且，常见免疫治疗的疗效也在与肿瘤糖酵解抑制剂联用后得到了显著提升。毫无疑问，这些结果将为提高肿瘤免疫疗法控制率、实现肿瘤精准治疗提供重要的理论基础。

然而，目前有关乳酸调控Treg的具体分子机制鲜有研究探索，考虑到新近研究表明蛋白质乳酸化修饰是乳酸发挥功能的重要方式，因此，乳酸化修饰很大程度上也将成为未来Treg等免疫细胞功能调控机制研究的重要切入点。

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