复方单体可以做热蛋白组？如何区分小分子直接或间接影响蛋白状态？|这题我会·热蛋白质组学（TPP）篇

大家好，景博士又和大家见面啦！【这题我会】问答专栏旨在解答科研人员在蛋白质（修饰）组学实验设计、数据分析等方面的各类疑问。关于蛋白质组学你想了解的，从技术原理、热点动态，到研究思路、实验方案设计，有疑问，记得私信留言告诉我们！景博士为你解答！

小分子代谢物与小分子药物在细胞的表观遗传、信号转导和细胞周期调控中发挥关键作用，并与癌症、自身免疫病、心脑血管疾病和神经退行性疾病的发生密切相关。本期【这题我会】，聚焦小分子代谢物与蛋白质研究中的常见问题。以下几道问题，景博士为您解答：

热蛋白质组学（Thermal Proteome Profiling，TPP）

1.在TPP实验中，与小分子结合后靶蛋白的热稳定性一定增强吗？

TPP的本质是检测蛋白质的状态变化，因此这个问题的本质是蛋白质的状态变化与其热稳定性是否存在必然联系——答案显然是否定的。而在我们的过往项目经验中，也常常遇见已验证过的小分子结合蛋白（阳性对照蛋白）在小分子处理后的热稳定性是下降的。

从这里展开来讲，蛋白质的热稳定性上升与下降，与该蛋白的功能是激活还是抑制、或者是小分子与蛋白的结合方式也没有必然的联系。TPP的结果能够为我们指出哪些蛋白质可能与我们关注的小分子存在相互作用，而具体的作用方式及其对蛋白质功能的影响则必须通过进一步的功能实验来确定。

2.如何区分蛋白状态改变是小分子直接作用还是间接作用？

TPP有两种实验策略，用来解决不同的科学问题。第一种是先用小分子处理细胞，再去做TPP筛选哪些蛋白质的状态发生了变化；第二种是先从样品中提取纯化出蛋白样品，再用小分子处理蛋白样品后做TPP。对于第一种，我们的检测对象实质上不只是小分子的靶蛋白，而是小分子处理细胞后细胞中所有状态发生了变化的蛋白质。而对于第二种策略，由于在蛋白样品中缺少修饰基团供体和蛋白-蛋白相互作用的其他条件，此时影响蛋白质状态的因素只有该蛋白是否能和我们加入的小分子发生相互作用，因此这种实验策略中检测到的就是能直接与小分子结合的蛋白。

3.复方（有效单体不明确）可以直接做TPP吗？

技术上是可行的，TPP能够检测出蛋白样品中与复方药物相互作用的蛋白质有哪些。但是在实际实验中存在一些风险因素，以复方中药为例，1. TPP无法区分具体是复方中的哪个成分引起了蛋白状态变化，即使检测到的靶蛋白，也无法确认其与复方中的具体哪一种成分建立相互作用关系；2. 根据我们的经验每种小分子能够结合的靶蛋白大致在10来种到一百多种不等，而由于复方中小分子成分复杂，TPP获得的靶蛋白数量可能较多，这会增大后续验证实验与功能实验的难度。

4.TPP实验所用的样品选择与药物浓度如何确定？

首先是样品选择。TPP的研究目的是找到能够与我们研究的小分子发生直接作用的蛋白质，因此样品选择的第一原则是选择蛋白表达谱能解决我们关注的科学问题的样品，例如想要研究CRC，就尽量选择人的CRC细胞系；想要研究AR拮抗剂在前列腺癌中的作用，就必须选择表达AR的前列腺癌细胞系。而对于组织样本，不建议体内给药后做TPP，原因是：1. 体内给药无法确定药物在目标组织中的具体工作浓度；2. 组织间隙液及ECM都会干扰实验结果。我们目前正在开发针对组织的TPP样本制备方法，预计25年4月起将支持各位直接寄送组织样本进行实验。

而对于小分子浓度，建议选择在细胞模型中有明显表型的工作浓度的3-5倍，来作为TPP的药物工作浓度。例如对于细胞杀伤性的小分子，我们可以选择IC50的3-5倍来进行TPP实验。