邹文安
TMT蛋白组及修饰组学初分析Q&A
1.Q：PEP是什么意思？
A：The maximalposterior error probability for peptides，最大后验概率误差，表示一个肽段/蛋白匹配是错误的概率，这个值越小越好。
2.Q：Mass error是什么意思？
A：Masserror反映的是仪器质量轴准确度及分辨率，绝对值越小表示准确度及分辨率越高。
3.Q：结果中score大小说明什么问题？
A：score反映的是鉴定结果的可信度，Score越高表示鉴定结果的可信度越高。
MaxQuant是基于统计的原理判断谱图的准确性，统计原则是FDR。MaxQuant搜库的蛋白组结果对score没有强制要求，而是通过统计的方法控制鉴定结果的FDR<1%，修饰组项目除了FDR以外还会另外卡score>40。
Mascot是根据实际谱图和理论谱图相似度进行评分，对蛋白、肽段、修饰肽段卡score>20。
4.Q：FDR是什么意思？
A：FDR是falsediscovery rate，表示假阳性率，要求FDR<1%。搜库所用的蛋白数据库称为正库，我们将所有蛋白的序列反过来作为反库，如果一个肽段序列既能归于正库，又能归于反库，则不可信。我们要求一个肽段归于反库的概率要小于1%。
5.Q：TQ的MS_identifiedinformation的score为什么有-2？
A：-2特定地表示对于这个蛋白只鉴定到一条修饰uniquepeptide（可变修饰：甲硫氨酸氧化和蛋白N端乙酰化）。
6.Q：PSMs是什么意思？
A：PSM表示二级有效谱图数，指匹配到的这个蛋白的二级谱图数。PSM可以作为蛋白丰度的粗略参考。
7.Q：Total spectrum和Match spectrum是什么意思？
A：Total spectrum指数据库中所有蛋白形成的二级谱图，Matchspectrum指鉴定到的二级谱图与数据库匹配上的数目。
8. Q：Localization probability是什么意思？图中S后面括号里是什么？
A：表示位点可能性，是指这个肽段的修饰落在这个氨基酸位点上的可能性，一般认为>0.75为发生这个修饰是可信的，对于糖基化，一般要求的是>0.5。肽段序列中括号内的数字也是表示的这个参数。
9.Q：MS_identified information表中主要看哪些信息？
A：蛋白的差异如何看ratio列和p-value列，如果有重复的主要看最后的总的实验组/对照组的ratio值，一般这两列在MS_identifiedinformation的protein_quant和peptide_quant表中的最后两列。通过筛选这两列的值可以分别得到fold1.2/1.3/1.5/2 differentially_expressed_protein，4个差异列表中的p-value都是满足<0.05的。
10.Q：Protein_quant表中样本名下面的数字表示什么？蛋白的ratio和p-value是如何计算的？
A：数字表示的蛋白在各样本中的相对定量值，是该蛋白所有uniquepeptide相对定量值中位数。如果出现空白或者NA时，表示没有定量到。Uniquepeptide不可定量是因为标签信号强度弱或者存在干扰等多种因素。
对于三次重复看的是最终的ratio值（即实验组所有重复和对照组所有重复相对定量值的均值之比）和样本间p-value。为了计算实验组和对照组之间的比值，首先将各个样本的相对定量值取log2（以使得数据符合正态分布），用实验组相对定量值的均值/对照组相对定量值的均值作为实验比较组最后的ratio值，然后用双样本双尾T检验来计算p-value。这种方法适用于至少三次重复的实验。
11.Q：在MS_identified information表中，unique peptide是不是越多越好，只有1条unique peptide的结果是否可信？
A：uniquepeptide表示蛋白特异性，越多表示蛋白鉴定的可信度越高；传统上认为uniquepeptide≧2的蛋白是可信的。但是随着现在质谱仪精度和分辨率的提高，uniquepeptide=1的蛋白数据也是被蛋白质组学领域公认的杂志如JPR、MCP等认可的，在文章发表前可能需要将原始数据上传（如Pride）供查看。
12.Q：如何评价和理解实验重复性的标准？
（1）RSD箱型图怎么理解？
A：RSD是相对标准偏差，是指标准偏差与测量结果算术平均值的比值，和CV值（变异系数）是相同的概念，可以用于评估实验的重复性。RSD箱型图是用每一个重复中蛋白的相对定量值做的，其方框中间表示所有蛋白RSD的中位数，方框上下边缘是指所有蛋白RSD的四分位数（即分别是75%和25%的分界线）。RSD的数值越小，通常意味着重复性越好。
（2）Pearson（皮尔森）相关系数怎么理解？
如图所示的是所有样本两两之间皮尔森相关系数Heatmap图，皮尔森系数是度量两组数据相关性程度的值。当皮尔森系数越接近于-1为负相关，越接近于1为正相关，越接近于0为不相关。皮尔森相关性系数虽然对重复性有一定的指示作用，但并非重复性评价的绝对标准，也不存在说实验一定要达到某个确定的相关性系数值。尤其注意的是，当实验组和对照组之间差异很小的时候，受到随机系统误差扰动的影响，皮尔森相关性系数会接近于0，这也并不代表实验的重复性就是差的。
（3）到底如何理解蛋白质组实验的重复性？
RSD和Pearson系数都是统计数据，都对实验重复性有一定的指征作用。但是一个生物学实验的重复性，需要结合具体的实验设计和场景，统计指标只是参考依据。通常我们认为一些差异大的蛋白/位点在不同实验中能够被重复得检测出来，那么则可以认为是可靠的。对于生物学重复，有时也不必太过拘泥于数字上的完美，只要能够得到足够的、有意义的差异数据，能够对解析生物学问题提供可靠的信息即可。
13.Q：A图和B图分别是什么，怎么理解？
A：A图是蛋白分子质量与蛋白序列覆盖度的图，用的数据是MS_identifiedinformation表中protein_quant的MW[kDa]和coverage的数值做的图。横轴表示蛋白的分子质量，纵轴表示蛋白序列的覆盖度——即某蛋白中鉴定到肽段的序列占该蛋白全部序列的比例。
A B
B图是质谱仪质量轴的一个检测，为判断仪器运行是否正常。横坐标是质谱鉴定到的肽段实际质量与肽段理论质量之差，单位ppm，纵坐标为：肽段在质谱分析软件MaxQuant/Mascot上的匹配情况打分。当质谱仪处于性能稳定状态时，分析得到的肽段误差应该以0为中心的正态分布，允许误差范围在-10ppm-10 ppm。与得分相比，当质量误差越小时，鉴定越接近真实肽段，那么质谱分析软件的打分就越高。
14.Q：图中Normalized modification sites quantitation是什么意思？是不是一定要做归一化？
A：表示的是用蛋白组数据对修饰组进行归一化后的结果，如果蛋白组中没有该蛋白定量信息，那么归一化后的结果中就没有数据。用蛋白组做归一化，可以排除蛋白变化对修饰水平产生的影响，从而可以查看修饰自身的变化[1]。归一化并非是强制的要求，要视具体情况而定。通常会推荐对修饰组做归一化，但当蛋白组差异很少、抑或是归一化后造成定量比例大幅降低的情况，也可以不进行归一化[2]。
参考文献：
[1] Hebert A S, Dittenhaferreed K E, Yu W, et al. Calorie restriction andSIRT3 trigger global reprogramming of the mitochondrial protein acetylome.[J].Molecular Cell, 2013, 49(1):186-199.
[2] Park J, Chen Y, Tishkoff D X, et al. SIRT5-Mediated LysineDesuccinylation Impacts Diverse Metabolic Pathways[J]. Molecular Cell, 2013,50(6):919-930.
15.Q：蛋白组和修饰组怎么挑选后续标准分析的阈值？
A：一般是控制阈值以使得单个比较组下差异蛋白个数占可定量蛋白数的5%-10%左右。过多和过少的差异都不利于后续的生信分析。除了差异个数的多少，如果对于一些关注的蛋白和过程中已知的marker蛋白也应尽量包括在差异列表中。对于同时检测蛋白质组和修饰组的项目，推荐选相同差异倍数，这样在发文章时比较合理。
此外，不建议一定要把所有比较组和所有检测类型的差异都选的很多，有时候部分组别确实没差别，这样的部分阴性结果也未必没有意义：
（1） 蛋白组差异多，修饰组差异少，就按照蛋白组数目进行差异倍数选择，说明表型主要是由蛋白质表达的差异引起；
（2） 如果蛋白组差异少，修饰组差异多，则按照修饰组差异蛋白数目选择差异倍数，说明表型主要是由蛋白质修饰而非表达的差异所引起。
16.Q：差异蛋白数目较少是为什么？
A：样本差异蛋白数目多少主要和样本本身的生物学差异大小有关。比如正常组织和病理组织之间的样本差异比较显著，得到的差异蛋白数目较多（一般差异蛋白数目占鉴定到蛋白总数的10%左右）。而病理组与药物处理组之间的差异不一定显著，如药物作用效果不佳、药物作用浓度不合适、取样时间不合适等因素都可能导致差异蛋白数目少。
差异蛋白数目少可能在标准分析中得不到丰富的结果，但是仍然可能为后续功能验证提供重要线索。
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