Nature最新突破，大脑皮质神经元投射的亚细胞转录组和蛋白质组研究

景杰生物/报道 

景杰编者按：神经元即神经细胞，是一类是具有特殊结构的细胞，其细胞特化，胞间距离较大，主要起联络和整合输入信息并传出信息的作用。 新生神经回路建立过程中的关键的亚细胞特化是在投射轴突的尖端处的生长锥(Growth Cone, GC)。神经回路的发育依赖于轴突投射在神经系统区域之间建立多种多样的连接。 每次投射都是由生长锥，即亚细胞特化在生长轴突的尖端形成，其中包含控制投射特异性生长和目标选择的分子。

1月9日，哈佛大学干细胞与再生生物系、干细胞研究所、脑科学中心Jeffrey D. Macklis在Nature杂志发表文章。他通过转录组和蛋白组定量来自体内单个投射的GC，最终开发了GC分选方法并得到亚细胞RNA-蛋白组图谱。

研究者通过研究小鼠大脑皮层，绘制了跨半球的GC富集图谱，对来自大脑的单个神经元亚型进行了蛋白质组和转录组进行分析。这些数据表明了GC的分子特化，包括生长调节激酶mTOR2的累积，以及含有mTOR依赖性motif的mRNA。研究者的发现阐明了RNA和蛋白质亚细胞分布在神经元投射中的关系，并为神经布线（circuit wiring）特意底物的发现、再生提供了系统级方法。

1. GC的纯化和分选

研究者为了从小鼠大脑中纯化GC亚型，对神经元进行体内荧光标记，通过亚细胞分离获得总的GC。为了从大量GC中特异性地纯化得到荧光标记的GC亚型，研究者改造和优化了荧光激活细胞分选仪，直接分类和收集荧光GC。

2. GC亚蛋白质组学分析

研究者首次报道了由胼胝体投射神经元形成的跨半球投射的神经线路特异性GC分选。研究者用表达GFP的质粒特异性地标记了皮层神经元的上层，通过GC分选，从出生三天的小鼠的对侧半球纯化跨半球GC，发现只有越过中线的生长中的胼胝体轴突有荧光。分选出来的GC用于蛋白质提取，以及后续质谱分析。

3. GC的投射特异的亚转录组和亚蛋白组分析

分别提取GC及其亲本的RNA和蛋白质，进行RNA测序和质谱分析，获得成对的GC亚转录组和亲本、GC亚蛋白组和亲本的结果。结果得到955个基因的高置信度数据集（mRNA和蛋白质分别用λR 和 λP,表示）。而这些数据又恰好使得我们能够基于配对的亚细胞mRNA和相应投射蛋白定位相应的基因，同时揭示了基因族群间显著的差异。

4. 亚细胞转录组分布遵循mTOR依赖性

在λR值得聚类当中，一个值得注意的模式出现在了转录组的数据中。尽管GC转录本含量较低，但研究者依然观察到5’端寡嘧啶（5′ terminal oligopyrimidine (TOP)）这类非标准motif的大量富集 。在检测到的83个TOP转录本中，大多数显示出GC富集的趋势，其中约一半富集具有统计学意义。99.8%的转录本都与mTOR信号通路相关，但是在蛋白翻译层面却还有20%的变化。

值得注意的是，TOP的翻译几乎完全依赖mTOR，呈现出“all or none”的模式。有一小部分含有核糖体进入位点或者不含poly A尾的非标准转录本不依赖mTOR，而这些转录本在数据集中处于TOP组的对立面。这说明基于mTOR对翻译的依赖性而言，生长的投射神经元的转录组具有显著的亚细胞极性。

 综上所述，研究者通过研究小鼠大脑皮层，绘制了跨半球的GC富集图谱，对来自大脑的单个神经元亚型进行了蛋白质组和转录组进行分析。

研究者的发现阐明了RNA和蛋白质亚细胞分布在神经元投射中的关系，并为神经布线（circuit wiring）特意底物的发现、再生提供了系统级方法。

参考文献：

1 Poulopoulos A, et al., 2019, Subcellular transcriptomes and proteomes of developing axon projections in the cerebral cortex, Nature.

2 Lowery, L. A., et al., 2019, The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

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