邹文安
景杰学术/精选
蛋白质修饰泛抗体可以从广谱水平上显示蛋白质的修饰，景杰公司有种类齐全的酰化修饰抗体，比如乙酰化，琥珀酰化，巴豆酰化，2羟基异丁酰化，丙二酰化。在Western Blot实验上，使用这些酰化修饰的泛抗体，以及组蛋白H3,H4,H2A,H2B上位点特异性组蛋白密码抗体，可以对生物样本的修饰水平进行评估和比较。除此之外，景杰公司还承接以识别修饰为目的的定制抗体项目，供客户用于Western Blot实验。
那么Western Blot的成功有哪些决定性的因素呢？小编今天将一些容易被大家忽略的Western Blot技巧总结如下。
1.取材是关键。对于活体动物，动物的处死方式，解剖时长，操作手法等，都可能影响到蛋白的表达水平或者修饰水平。因此精准的控制动物处死，解剖，灌流，器官剥离的操作，对Western Blot结果的重现性很有帮助。对于贴壁细胞，最为推荐的方式是在预冷PBS洗涤细胞之后，直接加入适量裂解液，在裂解液中刮取细胞。
2.蛋白裂解这一步的技巧性很强，并且至关重要。含有强表面活性剂的裂解液更能够有效的阻断蛋白降解或者修饰变化，并且能够最大程度的溶解细胞中的蛋白质。当然，裂解液和裂解方式的选择要根据样本类型和后续实验的需要，合理设计和测试。含有1% SDS的裂解液可以增加蛋白的稳定性，保持样品的原初状态，但是如果后续要进行IP实验，就不合适了。
3.如果实验目的是为了检测酰化修饰，那么相应的就需要在取材和裂解时，添加去酰化酶抑制剂（常用抑制剂，比如TSA，丁酸钠）。对于磷酸化实验，则需要添加磷酸酶抑制剂，避免样品处理过程中的脱磷酸化。对于所有的实验，添加蛋白酶抑制剂都是必须的。
4.Western Blot的实验过程看似简单，但是一不小心也会掉坑。跑胶上样量，转膜时间和温度，一抗和二抗的稀释倍数，封闭液的选择和浓度，洗涤液中Tween-20的浓度，洗涤的次数和时长，显色底物的灵敏度，显影或成像的参数，这些细节要需要针对不同的抗体进行优化。
5.Western Blot实验结果的解读和判断也是重要的一环。对于修饰泛抗体的western Blot，是否检测到的条带越多，就意味着蛋白的修饰丰度越高呢？如果是同一样品，不同处理的对比，那条带的多少是可以显示修饰的丰富程度的。如果是不同样品，不同来源，则没有可比性，比如肝组织和脑组织，在蛋白的成分，电泳的带型上完全不同，那么两者是无法比较的。
Western Blot检测结果示意图，可以看到不同组织的电泳带型有差别，相同组织在不同处理情况下条带的多少和颜色深度不同体现了修饰的丰富程度
6.磷酸化修饰经常会出现信号位置和非修饰蛋白的位置不一致的情况。蛋白发生磷酸化后，在SDS-PAGE上迁移缓慢已经有很多佐证。将磷酸化蛋白在SDS-PAGE进行分离，然后切除胶条进行质谱检测，发现大量磷酸化蛋白在胶上的迁移率与非修饰蛋白的迁移率不同，发生高度磷酸化的蛋白（每100个氨基酸有1个或更多的磷酸化位点修饰）的迁移率差别更为显著。由此可见，磷酸化修饰抗体的Western Blot信号对应的分子量位置大于非修饰抗体的检测信号位置是很常见的。
参考文献：
1.Nature. 2015 Nov 26;527(7579):545-51.
2.J Biomol Tech. 2015 Sep;26(3):103-12.
3.J Biol Chem. 1984 Feb 10;259(3):1834-41.
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