Nat Commun: 蛋白质组学鉴定肺神经内分泌癌不同亚型的特异性分泌蛋白标志物

景杰学术/解读

肺神经内分泌癌是一种在所有肺癌中占比约25%的恶性肿瘤，包含小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），类癌和不典型类癌。小细胞肺癌的生物学特色与非小细胞肺癌有明显区别，它是起源于神经内分泌细胞的并伴有低分子量多肽激素和生物胺的一种肿瘤。

近年来的研究已经发现SCLC存在明显的异质性，例如不同致癌基因（e.g., ASCL1, NEUROD1 and POU2F3）的表达，不同的生长特色，MYC家族成员激活等等。这些结果强调了对不同亚型的SCLC患者进行诊断以及精准治疗的必要性。然而，目前对于SCLC仍然缺乏可信的诊断生物标志物。分泌蛋白在肿瘤细胞以及其微环境中发挥了非常关键的信息传递和交流作用，同时当前基于高分辨质谱的蛋白质组学技术为更好的鉴定及分析细胞分泌蛋白提供了技术保障。因此，对肿瘤细胞分泌蛋白组的分析可能会有助于SCLC生物标志物的发现。

2019年7月19日，来自美国德克萨斯大学达拉斯西南医学中心的余永豪组在著名学术期刊Nature Communications上发表论文， 利用TMT蛋白质组学定量技术对肺神经内分泌癌进行分析，鉴定到亚型特异分泌蛋白标志物。研究人员对13个不同的细胞系培养液中分泌蛋白组进行检测，共鉴定到了1626个蛋白，并发现胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-like growth factor-binding protein 5，IGFBP5）可以作为ASCL1基因高表达SCLC亚型的生物标志物。ASCL1与IGFBP5结合并直接调节其表达。ASCL1敲除降低了IGFBP5蛋白的表达，从而导致IGF-1R信号通路过度激活。在体外和小鼠模型中，对ASCL1和IGF-1R的联合靶向用药展现出明显的协同效果。

文献精读

1、神经内分泌肺癌细胞的整体分泌蛋白组分析

作者分别从13个肺癌细胞系（正常以及不同的神经内分泌肺癌亚型）的培养液中提取蛋白进行检测（Figure 1a）。共鉴定到6616个蛋白，其中1626个蛋白在13个细胞系中均被鉴定出来。通过对这些蛋白的GO分析，发现这些蛋白主要参与到细胞外基质生物过程中，比如细胞黏附和抗原处理和呈递等等并且大部分处在细胞外或细胞膜区域（Figure 1b&c）。

图1 神经内分泌肺癌细胞的分泌蛋白组分析

二、神经内分泌肺癌特色分泌蛋白筛选

为了更精确的筛选出神经内分泌肺癌特异性表达的蛋白，研究者结合了之前已发表的转录组数据，人类血浆蛋白质组数据库以及本实验数据，共鉴定到76个候选蛋白。其中58个上调18个下调蛋白，并且它们在神经内分泌型肺癌细胞系中表现出了相似的表达模式（Figure 2a&b）。通过对这些蛋白的分析，发现它们主要富集在轴突引导、大脑发育以及神经元投射等过程，再一次预示了这些分泌蛋白标志物与神经内分泌肺癌之间的潜在联系（Figure 2c&d）。

图2 神经内分泌肺癌的特色分泌蛋白筛选和分析

三、肺神经内分泌癌亚型蛋白标志物鉴定

通过对7个ASCL1^High细胞系和5个NEUROD1^High细胞系的分泌蛋白进行对比，作者共鉴定到65个在俩种亚型种显著差异表达的蛋白，这些蛋白可以明确的将俩种亚型区分开（Figure 3a&b）。除此之外，作者对俩组已发表的人类小细胞肺癌转录组数据进行分析，发现IGFBP5和B4GALT1俩个基因在ASCL1^High细胞系中出现明显表达上调（Figure 3c）。通过对其他三个不同的小细胞肺癌转录组数据的分析，研究者发现IGFBP5与ASCL1有高度的关联性（Figure 3d）。

图3 ASCL1^High型肺神经内分泌癌的分泌标志物鉴定

四、IGFBP5是ASCL1的转录靶基因

由于ASCL1是一个转录因子，因此研究者推测IGFBP5与ASCL1的高度关联性可能源于它是ASCL1的一个直接转录靶基因。作者首先在细胞系中对ASCL1进行敲低，观测到IGFBP5的蛋白表达量显著降低，证明了ASCL1对IGFBP5正常表达的必要性（Figure 4a）。而在过表达ASCL1的细胞系中，IGFBP5的mRNA含量显著提升（Figure 4b）。

为了验证IGFBP5是否为ASCL1的直接靶基因，作者在细胞系中共表达ASCL1质粒与一系列插入了不同IGFBP5片段的荧光素酶报告基因（Figure 4c）。最终发现ASCL1可与IGFBP5基因E-box（CANNTG）结合。

图4 IGFBP5是ASCL1的直接靶基因

五、JQ-1和IGF-1R抑制剂诱导小细胞肺癌细胞死亡

已有研究表明ASCL1对高级别神经内分泌肺癌细胞的存活至关重要，而BET抑制剂能够通过抑制ASCL1的表达来影响小细胞肺癌的生长。由于ASCL1可直接作用于IGFBP5基因，因此作者进一步推测BET抑制因子能够影响IGFBP5的表达。作者首先用BET抑制剂JQ-1/另一种BET抑制剂iBET-762/DMSO分别处理细胞系，发现ASCL1和IGFBP5的蛋白表达量都显著下降（Figure 5a）。

胰岛素样生长因子结合蛋白是一个与IGF-1有高度亲和性的蛋白家族，作者已经报道过IGFBP5通过结合IGF-1R来阻碍其正常信号和功能的表达。由此作者推测，JQ-1处理可缓解IGFBP5对IGF-1信号通路的干扰，并证实了该假设（Figure 5b）。为了研究增强的IGF-1R信号是否能够促进JQ-1处理的细胞存活率，作者评估了JQ-1/BMS-754807（IGF-1R抑制剂）/俩者联合用药对小细胞肺癌细胞系的生长抑制作用。结果显示，俩种抑制剂的联合处理显著引起了ASCL1^High小细胞肺癌的细胞死亡（Figure 5c）。

图5 JQ-1和IGF-1R抑制剂诱导小细胞肺癌细胞死亡

总而言之，研究者运用基于质谱的高通量蛋白质组学对肺神经内分泌癌不同的细胞系进行了分泌蛋白的全面分析，不仅鉴定到肿瘤特异性分泌蛋白，还发现了亚型（ASCL1基因高表达）特异性分泌蛋白标志物- IGFBP5。ASCL1可与IGFBP5结合并直接调节其表达。ASCL1敲除降低了IGFBP5蛋白的表达，从而导致IGF-1R信号通路过度激活。ASCL1和IGF-1R的抑制剂联合处理可有效引起肿瘤细胞死亡。这项研究再一次证明了蛋白质组学在肿瘤领域分子分型，标志物检测及诊断治疗方面的巨大作用。