【微信图文】生信干货 | 多修饰关联分析

大规模蛋白质组学实验可以在一次实验中鉴定出数千种蛋白质翻译后修饰位点，为蛋白翻译后修饰研究提供了便利的条件。所有活细胞的蛋白质都会经历无数的翻译后修饰 (PTM)，这些修饰对多种多样的生命过程至关重要。常见的PTM包括磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化和SUMO 化等，这些 PTM 具有调节靶蛋白的活性和稳定性、蛋白质相互作用和细胞内分布的作用，不仅使蛋白质的功能更加多样化，而且还作为一种开关，使细胞或生物体能够快速而严格地对压力做出反应。因此对多种PTM进行研究，了解不同的 PTM 组学特征，有助于我们深入了解生命过程的生物学机制。

今天我们将通过分享一篇关于锥虫多种蛋白翻译后修饰研究的文献，来介绍多种翻译后修饰组学研究的相关思路和生信分析模块。

2020年4月，沈阳农业大学陈启军教授课题组在Cell出版社新子刊iScience上发表题为Landscapes of Protein Posttranslational Modifications of African Trypanosoma Parasites的论文。研究者对两种不同表型具有明显进化差异的锥虫（布氏锥虫和伊氏锥虫），进行了蛋白质组学和10种蛋白质翻译后修饰组学的分析，共鉴定到约40000个修饰位点和150个组蛋白修饰位点，并系统的揭示了驱动锥虫发育差异的分子机制。该研究是目前锥虫蛋白质翻译后修饰最为全面的研究，为研究具有明显进化差异的真核生物提供了有价值的模型。此外，研究者还构建了两种寄生虫的翻译后修饰数据库，为研究者深入理解不同生命周期锥虫生命过程的生物学机制提供了强有力的数据资源。

布氏锥虫和伊氏锥虫的蛋白质组学分析

整个研究的技术路线如Fig.1 A所示，基于质谱手段，测定了蛋白质组学、磷酸化修饰组学、N-糖基化修饰组学、乙酰化修饰组学、巴豆酰化修饰组学、2羟基异丁酰化修饰组学、丙二酰化修饰组学、琥珀酰化修饰组学、泛素化修饰组学、三甲基化修饰组学以及O-糖基化修饰组学10种蛋白质翻译后修饰组学。定量蛋白组学的PCA结果表明生物学重复良好(Fig.1 B)，经对数转换后的定量值呈明显的正态分布，值域属于-10到10之间 (Fig.1 C)。在布氏锥虫和伊氏锥虫中分别鉴定出3,957和3,450种蛋白质，其中2,123种蛋白质在两个物种中均鉴定到 (Fig.1 D)。

接着，作者将差异蛋白分为四类：Tb-e（在布氏锥虫三个样品均有定量而在伊氏锥虫中未鉴定到）, Te-e（在伊氏虫三个样品中均有定量而在布氏锥虫中未鉴定到）, Tb-h（布氏锥虫显著高表达FC > 2.0 且P value < 0.05）, 以及 Te-h（伊氏锥虫显著高表达）。四类蛋白质亚细胞定位主要富集在细胞核和细胞质中（Fig.1 E）。进一步地，作者对四类蛋白进行KEGG富集分析，发现Tb-e和Tb-h蛋白显著富集在三羧酸循环代谢通路中 (Fig.1 F)。

布氏锥虫和伊氏锥虫的翻译后修饰组学分析

Fig.2A展示两个物种中10种PTM的鉴定深度, 布氏锥虫和伊氏锥虫分别鉴定到42,656个及33,040个修饰位点。其中琥珀酰化修饰鉴定深度在两个物种之间存在高度差异 (Fig.2 A)。通过与锥虫寄生虫物种中的近缘物种进行多序列比对，发现这些修饰位点的保守性更高，预示这些位点可能具有重要的功能意义 (Fig.2 B)。最后，Circos图展示了两个物种的多修饰全景图，直观地展示了两个物种蛋白组及PTMs的相似性与差异性 (Fig.2 E)。

非洲锥虫在组蛋白翻译后修饰中高度保守

在两种非洲锥虫中均有大量的组蛋白翻译后修饰位点被检测到（Fig.3 A），在布氏锥虫中共发现了 162 个组蛋白修饰位点，其中 135 个是新发现，而伊氏锥虫中的 134 个翻译后修饰位点均为首次报道。两种寄生虫共同鉴定到 119 个组蛋白修饰位点，且差异分析显示组蛋白H2A.Z中K164、K168 和 K169三个位点在伊氏锥虫中具有更高的乙酰化水平 (Fig.3 B)。

RNA结合蛋白（RBP）调控锥虫基因表达的元件发生了多种翻译后修饰

RNA结合蛋白（RBP），调控锥虫基因表达的元件，发生了多种翻译后修饰

研究者构建了RBPs和底物蛋白的蛋白-蛋白互作网络。鉴定出的 RBPs 主要参与 RNA 处理、剪接和核糖体生物发生。丙酮酸激酶 1（PYK1，TritrypDB: Tb927. 10.14140），一种参与糖酵解途径的限速酶，也表现出 RNA 结合活性，且在两种锥虫中受到六种翻译后修饰的调控。PYK1的修饰水平变化很可能会影响各种代谢途径中蛋白质的表达（Fig. 4）。此外，PUF8蛋白在布氏锥虫的特异性表达和修饰可能揭示了 rRNA 成熟的不同机制 (Fig.4)。

激酶-磷酸化修饰位点调控网络解释差异磷酸化关键因子

研究者还分析了布氏锥虫和伊氏锥虫的磷酸化序列，发现两物种间的磷酸化修饰序列motif具有不同的模式，显示出两种锥虫之间作用激酶的特异性。结果显示在布氏锥虫中，CMGC激酶家族作用的Motif(脯氨酸位于+1位)磷酸化水平更高，而在伊氏锥虫中，TAF1和CMGC/CK2激酶催化的Motif(天冬氨酸或谷氨酸位于+1位)磷酸化水平更高（Fig.5 B）。

本研究还预测了激酶与其底物磷酸化位点之间的潜在调控网络，发现激酶的差异表达和自磷酸化都与整个蛋白组的磷酸化水平紧密相关。在布氏锥虫，cdc2- 相关激酶 6（CRK6，TritrypDB: Tb927.11.1180）表达的升高和 CRK3 的酪氨酸Y34自身磷酸化的升高，影响了其他蛋白的磷酸化水平（Fig. 5 C 和 Fig.5 D），而且Y34 位点位于 ATP 结合位点，这些都是导致布氏锥虫和伊氏锥虫磷酸化存在差异的关键因素。